ウェスタンブロッティング プロトコール

標準的免疫検出法と迅速免疫検出法

1. 抗体の非特異結合を防止するためのメンブレンのブロッキング
2. 対象のタンパク質と結合する一次抗体反応
3. 未結合の一次抗体をすべて除去するための洗浄
4. 一次抗体と結合する標識二次抗体反応
5. 未結合の二次抗体をすべて除去するための洗浄
6. 目的のタンパク質を検出するため、標識二次抗体と基質の反応

標準的免疫検出法

• 一次抗体（対象とするタンパク質に対して特異的）
• アルカリホスファターゼまたはホースラディッシュペルオキシダーゼで標識された二次抗体（一次抗体に対して特異的）
• 酵素コンジュゲート（HRP または AP）に適した基質
• 適切な洗浄バッファー：リン酸緩衝化生理食塩水（PBST）：10mMリン酸ナトリウム、pH7.2、0.9% （w/v）NaCl、最高0.1% Tween-20界面活性剤、TBST：10mM Tris、pH7.4、0.9%（w/v）NaCl、最高0.1% Tween-20。
• ブロッキング溶液：ウシ血清アルブミン（BSA）、0.2%～5%（w/v）、Tween-20（0.05～0.1%）、無脂乾燥スキムミルク（0.5～5%）、カゼイン（1%）
• Milli-Q 水

• ブロットを保持するのに十分な大きさの浅いトレイ
• ガラス製のプレート
• プラスチック製ラップフィルム（例：サランラップ）、フリーザーバッグまたはシートプロテクター
• オートラジオグラフィーフィルムとカセット
• 暗室
• オートラジオグラフィーフィルム処理装置

1. 一次抗体をブロッキング溶液で希望の実用濃度に希釈します。
2. 二次抗体をブロッキング溶液で希望の実用濃度に希釈します。

ウェスタンブロッティング プロトコール

基質の検出

1. メーカーの説明書に従って基質を調製します。
2. ブロットを清浄な容器内に配置し、メンブレンの表面が完全に覆われるまで基質を添加します。軽く撹拌しながら10分間、またはシグナルが希望するコントラストに達するまで反応させます。
3. ブロットをMilli-Q水で洗浄して反応を停止します。
4. 減退を最小限に抑えるために、直接光を避けてブロットを保管します。ブロットは、乾燥状態で保管可能です。

1. メーカーの説明書に沿って進めていきます。
2. メーカーの説明書に従って基質を調製します。
3. ブロットを容器内に配置し、メンブレンが完全に覆われるまで基質を添加します。1分間反応させます。
4. 余分な基質を廃棄します。
   
   注： 定寸シートプロテクターまたはフリーザーバッグも利用可能です。
   
   
5. 気泡を残さずゆっくりと取り除きます。暗室内で、ラップされたメンブレンをフィルムカセット内に配置します。
6. オートラジオグラフィーフィルムを1枚の最上部に配置して、カセットを閉じます。
7. フィルムを露光します。最適な露光時間を決定するには15秒～30分の露光を複数回行う必要があります。1～5分が一般的です。

• イモビロン-FLトランスファーメンブレン上にブロットされ、抗体でプローブされたタンパク質
• Mylarラップフィルム
• 蛍光画像装置

1. メーカーの説明書に従って基質を調製します。
2. ブロットを希釈した蛍光色素標識二次抗体溶液内に配置し、穏やかに撹拌しながら1時間反応させます。
3. ブロットを洗浄バッファーで 3～5回、各回5分間洗浄します。
4. ブロットを清浄なフィルターペーパー上に配置して乾燥させます。
5. ラップフィルムを使用する場合には、Mylar製を使用します。サランラップは蛍光をクエンチするので、使用しないでください。
6. 適当な蛍光スキャナーを用いて、ブロットを画像化します。

迅速免疫検出法

• 一次抗体（対象とするタンパク質に対して特異的）
• アルカリホスファターゼまたはホースラディッシュペルオキシダーゼで標識された二次抗体（一次抗体に対して特異的）
• 酵素コンジュゲートに適した基質
• リン酸緩衝化生理食塩水（PBS）（PBS錠剤 524650-1EA）：10mMリン酸ナトリウム、pH7.2、0.9% （w/v）NaCl
• 抗体希釈バッファー：1%（w/v）BSA（ウシ血清アルブミン）、0.05%Tweenツイーン-20界面活性剤（カタログ番号 655204-100ML）
• 100%メタノール
• Milli-Q水

• ブロットを保持するのに十分な大きさの浅いトレイ
• プラスチック製ラップフィルム（例：サランラップ）、フリーザーバッグまたはシートプロテクター
• オートラジオグラフィーフィルムとカセット
• 暗室とオートラジオグラフィーフィルム処理装置

1. 乾燥したメンブレンを用いる際には、ブロットを完全に乾燥させます（「メンブレンの乾燥方法」プロトコールを参照）。メタノールでブロットを再度湿潤化しないでください。
2. 一次抗体を希釈バッファーで希望の実用濃度に希釈します。
3. 二次抗体を希釈バッファーで希望の実用濃度に希釈します。注：メンブレン1cm²当たり0.1mLの抗体溶液（一次および二次）に十分な量の溶液を調製してください。

1. ブロットを一次抗体溶液内に配置し、撹拌しながら1時間反応させます。溶液が、メンブレン表面全体を自由に移動できるようにしてください。
2. ブロットをPBS内に配置し、5分間洗浄します。
3. ブロットを二次抗体溶液内に配置し、撹拌しながら30分間反応させます。
4. ブロットをPBS（PBS錠剤 524650-1EA）内に配置し、5分間洗浄します。新鮮なバッファーを用いて2回繰り返します。
5. 「標準的免疫検出法」プロトコールの記載に従い、発色方式、化学発光方式または蛍光方式のタンパク質検出に進みます。

高いバックグラウンドを除去するための高塩濃度洗浄

1. 一次抗体および二次抗体反応まで標準的免疫検出法に従います。
2. 二次抗体を反応させた後、ブロットを高塩濃度のバッファー内に配置し、穏やかに振とうさせながら30分間反応させます。
3. ブロットをMilli-Q水で洗浄し、標準的免疫検出法の記載に従い発色方式、化学発光方式または蛍光方式のタンパク質検出法に進みます。

洗浄バッファーに0.5M NaClおよび0.2% SDSを添加すると、高いタンパク質結合能力を有するイモビロン-PSQメンブレンのバックグラウンドが顕著に低下します。

メンブレン ストリッピング プロトコール

Re-Blot Plus

• 抗体ストリッピング溶液に、刺激臭の強いβ-メルカプトエタノールを含有していません。
• 室温で抗体のストリッピングが可能です。ブロットの加熱は不要です。
• 室温で、ブロットから抗体を15分程度でストリッピングできます。
• ブロットは25分後に再利用できます。

• マイルド抗体ストリッピング溶液（10×）－（容器1個、50 mL）。（カタログ番号2502として個別に購入可能）。
• ストロング抗体ストリッピング溶液（10×）－（容器1個、50 mL）（カタログ番号2504として個別に購入可能）。

• 抗体ストリッピング溶液の希釈
• 用時調製： 抗体ストリッピング溶液（マイルドまたはストロング）を蒸留水（カタログ番号 486505）で10倍希釈して1 ×溶液を作製します。抗体ストリッピング溶液が結晶を含有する場合には、結晶が完全に溶解するまで37℃で軽く温めます。反応時間中にストリップまたはブロットが自由に移動できるように、十分量の溶液、一般的にストリップ1本当たり4 mL、または標準的なブロット1枚当たり20 mLを調製します。

1. ブロットのストリッピング：定量の1×抗体ストリッピング溶液でプラスチックトレーを満たします（提案量については、上記「試薬の調製」を参照）
2. ピンセット等を用いて、ブロットまたはブロットストリップをストリッピング溶液に浸漬します。穏やかに混合しながら室温で15分間反応させます。
   
   注：一度ストリッピングされたブロットを再び使用する場合には、ストリッピング反応時間を延ばしたほうがよいかもしれません。必要ならストリッピング時間を5～10分長くしてください。
   
   
3. ブロッキング：清浄なプラスチックトレーを等量のブロッキングバッファーで満たします。従来型のブロッキングバッファー、例えば20 mM Tris HCl、pH8.0；150mM NaCl；0.1% Tween 20（カタログ番号 655204-100ML）；5%乾燥スキムミルク等または類似品が適当です。
4. ブロットをブロッキングバッファーで2回、各回5分間洗浄します。
5. これでブロットはいつでも抗体を用いてリプロービングできます。ユーザーは、独自の検証済みのプロトコールおよび化学発光検出法を採用することをお勧めします。

加熱および界面活性剤によるストリッピング

• ストリッピング溶液：100mMの2-メルカプトエタノール、2％（w/v）SDS、62.5mM Tris-HCl、pH6.7
• リン酸緩衝生理食塩水（PBS PBS錠剤 524650-1EA）：10mMリン酸ナトリウム、pH7.2、0.9％（w/v）NaCl
• ブロットを保持するのに十分な大きさの浅いトレイ

1. ドラフトチャンバーにおいて、ストリッピング溶液内にブロットを置いて、振とうしながら50℃で30分間インキュベーションします。
2. ブロットをバッファー内に配置し、10分間振とうします。新しいバッファーを用いて繰り返します。
3. （オプション）抗体の不活性化またはメンブレンからのストリッピングを確認するために、最初の検出プロトコールを繰り返します（一次抗体ステップは省略）。
4. ブロットをバッファー内に配置し、10分間振とうします。
5. ブロッキングステップに進んで次ラウンドの免疫検出を行います。

低pHによるストリッピング

• ストリッピング溶液：25mMグリシン-HCl、pH2、1％（w/v）SDS
• リン酸緩衝生理食塩水（PBS PBS錠剤 524650-1EA）：10mMリン酸ナトリウム、pH7.2、0.9％（w/v）NaCl
• ブロットを保持するのに十分な大きさの浅いトレイ

1. ブロットをストリッピング溶液内に配置し、30分間振とうします。
2. ブロットをバッファー内に配置し、10分間振とうします。新しいバッファーを用いて繰り返します。
3. ブロッキングステップに進んで次ラウンドの免疫検出を行います。

低pHおよび加熱/界面活性剤法を用いた、イモビロン-Pメンブレン上でのストリッピングおよびリプロービング。（A）イモビロンウェスタンHRP化学発光基質による可視化を行う前に、ラット肝臓細胞抽出液のメンブレンブロットについて、ウサギ抗-ERK-1抗体（1：5,000）およびHRP-標識ヤギ抗－ウサギ二次抗体（1：20,000）を用いてプロービングしました。次に、ブロットについて（B）低pHまたは（C）加熱/界面活性剤によりストリッピングを行い、二次抗体およびイモビロンウェスタン基質に再度曝露して、すべての抗体が完全に除去されたことを実証しました。次に、ストリッピングした抗-ERK-1のブロットをマウス抗-HSP70抗体（1：10,000）およびHRP-標識ヤギ抗マウス二次抗体（1：5,000）を用いてプロービングし、そして上記の通り可視化しました。（E）低pHおよび（F）加熱/界面活性剤によりストリッピングしたブロットは、瑕疵なくリブロービングされ、そして（D）HSP70 に対する抗体のみでプロービングしたメンブレンに匹敵する結果が得られました。

ペプチド阻害/競合

1. ウェスタンブロッティングの抗体で最適な希釈率として使われる抗体の希釈率を決めます。
2. 中和する場合には、少量のTBSやPBS-スキムミルク（1mL）内で、抗体を5倍（重量）量のブロッキング用ペプチドと混合するか、最終容量のインキュベーションバッファー（TBSやPBS（PBS錠剤 524650-1EA）に溶解した3 %無脂肪乾燥スキムミルク）内で、抗体を10µM～25µM*の濃度のペプチドと混合します。ペプチドの計算事例については下記を参照してください。
3. ペプチドと抗体を、室温で2時間、または4℃で一晩振とうしながら反応させます。
4. 中和後、抗体/ペプチド混合物をしかるべき最終実用容量に希釈し、そして希望の試験プロトコールに進み、通常どおりウェスタンブロットの手順に進みます。

ブロットの保存

• ドライブロット イモビロンPVDFトランスファーメンブレン
• Whatman 3 MMペーパー、2枚
• カードストックまたは薄いボール紙、2枚
• 紙クリップ
• プラスチック製のバッグ

1. 乾燥したブロットを、2枚のきれいなWhatman 3 MMペーパーの間に挟みます。
2. ブロット－フィルターペーパーサンドイッチを　2枚のカードストックの間に挟みます。
3. この重ね合わせたものを端部に沿ってクリップで止めます。クリップは、ブロットと重ならないようにしてください。
4. 密封可能なプラスチック製のバッグに配置します。
5. バッグを閉じるか密封してください。
6. ブロットを適切な温度で保管します： 4℃で最長2週間、－20℃で最長2ヶ月、－70℃ではさらに長期間保管します。

• TBS錠剤（カタログ番号 524750-1EA）
• 蒸留水（カタログ番号 4.86505.0500）
• OmniPur BSA（カタログ番号 2910）
• PBS錠剤（カタログ番号 524650-1EA）