神経筋接合部(Neuromuscular Junctions, NMJ)はヒトを含む動物のあらゆる骨格筋に関連する「動作」「会話」「摂食」「呼吸」などを制御する高度に特異化したシナプスであり、我々の生存にとって必要不可欠である。疾患、損傷または加齢などによるNMJの機能低下は、肉体的な活動の衰えを引き起こし、心血管系、骨格系、その他あらゆる臓器の複雑なネットワークの中で支えられている恒常性を崩壊させる。
運動神経終末と骨格筋のシナプスであるNMJの形成は、胚発生時に運動神経軸索が標的細胞に向けて正しく伸長されることにより開始される。ケモアトラクタントやケモリパレントなどのガイダンスによる軸索伸長によって運動神経終末は、正確にその標的細胞と接触することができるが、どのようにこの運動神経終末が骨格筋を認識するのかは未解明な点が多い。しかしこれまでの知見から、骨格筋由来のシグナルは骨格筋特異的受容体型チロシンキナーゼMuSK (Muscle Specific Kinase)や、それと複合体を形成し、運動神経から分泌されるヘパラン硫酸プロテオグリカンであるAgrinの共受容体としての重要な機能をもつLDL Receptor-Related Protein 4 (Lrp4)依存的である事が示唆されていた。そこで私はこれら分子のいずれか、または両者が骨格筋由来の逆行性シグナルである可能性を検討した。これまで非常に困難であった運動神経のin vitro培養系を確立し、非骨格筋細胞との共培養系や精製タンパク質を用いた分子細胞生物学的手法により、Lrp4がこれまで永らく探し求められていた骨格筋由来のダイレクトな逆行性シグナルである事を示した。更にこの現象をマウス遺伝学によってin vivoにおいても正しい事を証明した。このことからLrp4は、「運動神経から骨格筋」へのシグナル伝達に重要なばかりでなく、逆に「骨格筋から運動神経」という逆行性シグナルとして終末分化を誘導する重要な役割を担っており、「双方向性のシナプス制御因子」であることを明らかにした。
筋萎縮性側索硬化症(Amyotrophic Lateral Sclerosis, ALS)は成人発症型の非常に重篤な神経筋接合部疾患である。患者の多くは徐々に全身の骨格筋の機能とともに運動機能を失い、疾患後期には運動神経細胞死を伴い、終末期において呼吸筋の機能不全により絶命する。約17％の患者は家族性であり、原因遺伝子の解明が進んでいるが、残りの80％以上はその遺伝的相関が無く、突発的に発症すると考えられている。したがって、この疾患の原因や病態の大部分については不明である。ALSの主な病態の一つとして挙げられる「運動神経細胞の細胞死」は相対的にこれまでの研究が進んではいるものの、この現象は疾患の非常に後期に現れるため、ALS発症メカニズムの解明にはより早期の病態に着目した研究が望まれる。唯一知られる家族性と突発性ALSに共通する初期症状は「運動神経終末の骨格筋からの乖離」である。NMJにおける神経終末と骨格筋との接着を維持する分子機構の多くは不明であるが、MuSKの役割が不可欠であるという事実は、Lrp4の運動神経終末へのシグナルの変質がALSの発症、または進行に寄与している可能性を示唆している。本シンポジウムではこうした観点から、NMJの発生生物学をLrp4の機能を中心に述べ、それに関連した病理学について最新の研究結果とともに議論したいと考えている。

我々の脳は様々な感覚情報を入力したうえで運動という形で出力を行う。そのための精密な神経回路がどのようにして作られるのかという問いは、発生生物学・神経科学における大きなテーマの1つである。我々はマウス嗅覚系をモデルにこの問題に取り組んでいる。マウス嗅覚系では、匂い分子は約1000種類の嗅覚受容体（匂いセンサータンパク質）によって検出されている。鼻腔の嗅上皮上に存在する個々の嗅神経細胞は1種類の嗅覚受容体のみを発現しており、同種の嗅覚受容体を発現する嗅神経細胞の軸索は脳の嗅球において特定の糸球体へと収斂する。従って、匂いによって活性化された嗅覚受容体の情報は、嗅球表面のどの糸球体が発火したかという情報、すなわち「匂い地図」に変換されることとなる。我々のこれまでの研究から、この匂い地図が嗅覚受容体そのものによって生み出されるシグナルの強弱に基づいて作られること、嗅神経細胞の軸索間相互作用によってつくられることが明らかになっている。
それでは、嗅球上に展開されたこの匂い地図は脳でどのように読み解かれているのだろうか？また、そのような回路はどのようにして作られるのだろうか？我々はまず、脳内の複雑な神経回路を可視化するために、組織を簡便に透明化する試薬SeeDBを開発した。SeeDBを用いると、嗅球内の詳細な神経回路の可視化が可能となり、情報処理過程、発生過程の解析が可能となった。更に、遺伝学的な解析から、嗅球内の精密な神経回路の発達が神経活動によって制御されていることが明らかになってきた。

適切な形態は、器官の機能発現にとって重要な要素の一つであり、形態形成のメカニズムを理解することは個体発生学の大きな目標の一つである。近年様々なアプローチによりその分子メカニズムの一端が明らかになりつつあるが、器官の形態形成は、個々の細胞の分化や増殖、移動といった複数の異なるイベントが同時に起きる極めて複雑な現象であるため不明な部分も多い。そこで我々は、ES細胞の3次元培養系を用いて中枢神経系の組織発生の試験管内再現を目指し、これまでにマウスおよびヒトES細胞から網膜前駆神経上皮組織を誘導し、立体的な“眼杯”様構造への形態変化をin vitroで再現できる実験系の構築に成功した。レンズや間葉系細胞などの周辺組織がないin vitro培養系においても眼杯形成が再現できたことから、網膜前駆神経上皮組織に内在する自己組織的な眼杯形成メカニズムの存在が示唆された。さらに、同様の神経上皮組織の自己組織化培養法を用いて、マウスおよびヒト大脳組織の層構造形成にも成功した。ヒトの大脳発生ではマウスと異なる挙動を示す細胞（outer radial glial cell）が存在し、大脳形態の種特異性を獲得するために重要な働きをすることが知られているが、我々のヒトES細胞からの分化培養系にも同様な細胞が存在し、in vitroの3次元培養系において種特異的な発生様式が再現されることが明らかになった。今回は、このような上皮組織の自己組織化的な形態形成メカニズムについて明らかになってきたことを紹介するとともに、in vitroでの機能的な器官形成についての今後の展望も合わせて議論したい。
参考文献
Eiraku et al., Nature, 472,51 (2011)
Nakano et al., Cell Stem Cell, 10,771 (2012)
Eiraku et al., Cell Stem Cell, 3,519 (2008)
Kadoshima et al., PNAS, 110,20284 (2013)

人工多能性幹細胞（iPS細胞）は再生医療への応用において大きく期待されているのみならず、疾患特異的iPS細胞の作製により、疾患メカニズムの解明や創薬にも応用可能であることが示されている。iPS細胞樹立には、遺伝子配列の変化は必要としない一方で、DNAメチル化などのエピジェネティック修飾状態がダイナミックに変化することが知られる。同時に、iPS細胞樹立過程において、体細胞は自己複製能を獲得し、無限に増殖可能となる。幹細胞性の獲得と発がん過程の共通点が見いだされる。我々は、これら二つの細胞運命変化における類似性に着目し、iPS細胞作製技術を発がん過程の理解に応用する取り組みを行っている。
幹細胞性の獲得と発がんとの関連を明らかにするために、薬剤依存的に全身で細胞初期化因子を誘導できるマウスを作製した。生体マウスにおいて細胞初期化因子を強制発現させると、生体内で多能性幹細胞が誘導できることが確認され、生体内細胞初期化システムが構築された。興味深いことに、生体内において部分的な細胞初期化を誘導すると、自律性に増殖を続ける異型細胞が出現し、がんに類似した病変を形成することが分かった。組織学的、分子生物学的な解析により、これらのがん類似病変は小児芽腫に類似することが明らかとなった。Reduced Representation Bisulfite Sequencing (RRBS)法によりDNAメチル化状態を解析したところ、観察された小児芽腫類似病変では、DNAメチル化状態の大きな改変が確認された。細胞初期化に関わるエピゲノム制御変化と小児芽腫発生との関連が示唆された。本発表では、生体内細胞初期化による腫瘍発生モデルを紹介し、幹細胞性獲得と発がんの接点について議論したい。

心臓疾患は世界の死因1位であり、重症心不全患者においては心移植が現在唯一の治療法であるが、この心移植に代わるものとしてヒト多能性幹細胞(iPS/ES細胞等)由来の心筋細胞移植の実用化が望まれている。そのためにはまず、効率的で安全性の高い多能性幹細胞-心筋分化誘導法が必要である。しかし従来の心筋分化誘導法は、成長因子や血清、動物由来成分など大量の蛋白質を用いており、コストや安全性の面で実用化には適していない。
我々は心筋分化に関わる細胞内WNTシグナルを制御する小分子化合物KY02111をケミカルスクリーニングにより発見し、それを用いて高効率で安全性の高いゼノフリー心筋分化誘導法を開発した。この方法は複数のiPS/ES細胞株に対し、安定して90％以上の効率で心筋細胞へ分化させることができる。また使用する蛋白質が少なく、動物由来成分も含まないため、低コストで安全性の高い心筋細胞が得られる。そしてさらに、遺伝子発現パターンや細胞内筋繊維構造がヒト心筋細胞の特徴を示しており、また電気生理学的解析では薬剤誘導性QT延長が見られることから、実際の成熟した心臓組織に比較的近い、実用的な心筋細胞に分化していることを明らかにしている。これらの知見を基に、我々の心筋分化誘導法で得られたヒトiPS-心筋細胞の臨床レベル実用化への展望と、今後の課題を述べたい。

近年、多能性幹細胞を用いた再生医療研究においても、３次元的な高次構造の再構築を伴う（例えば、血管網の付加など）異種細胞が適切に時空間的に配置された「臓器の人為的構成」に基づき細胞の分化誘導を試みる手法に注目が集まっている。我々は、肝発生の初期プロセスに必須である前腸内胚葉細胞と未分化血管内皮細胞と間葉系幹細胞との細胞間相互作用に着目し、胎内で生じる形態形成プロセスを模倣することのできる三次元培養系（臓器原基構成法）を確立することに成功した。本法を用いることにより、試験管内においてヒトiPS細胞から立体的な肝臓原基を誘導することが可能であり、それらは移植により血管構造を有する機能的なヒト臓器へと成熟することを示してきた（Nature, 499 (7459), 481-484, 2013）。さらに、本法を用いてヒトiPS細胞から創出したヒト肝臓原基を免疫不全マウスに移植することにより、ヒト血管網を有した機能的なヒト肝臓が構築され、治療効果が発揮可能であること、すなわち、肝不全モデル動物の生存率を著しく改善することが判明した。本講演では、我々が確立したヒト肝臓の人為的構成法について概説するとともに、最適な異所性移植の手法の検討状況などの最新の検討状況を紹介する。