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Variante impedita stericamente di Fmoc-Asp(OtBu)-OH
Nonostante i molti progressi degli ultimi anni, la formazione di aspartimmide resta un problema irrisolto, soprattutto nella sintesi di peptidi lunghi, in quanto l'esposizione ripetuta alla piperidina della catena peptidica in allungamento comporta l'accumulo di sottoprodotti correlati all'aspartimmide (Figura 1). Mentre in molti casi le aspartimmidi e le α- e β-piperididi generate da questa reazione collaterale possono essere separate con facilità dal peptide desiderato per mezzo dell'HPLC, è quasi impossibile rimuovere i peptidi β-aspartile e il peptide α-aspartile epimerizzato, dal momento che essi hanno spesso lo stesso tempo di ritenzione del peptide bersaglio. Inoltre, avendo anche la sua stessa massa, la loro presenza è difficile da rilevare.
Dunque, l'attuazione di strategie di sintesi che riducano al minimo la formazione di aspartimmide è un prerequisito per ottenere, con una buona resa, peptidi omogenei contenenti aspartile. Per questo motivo, Novabiochem ha sviluppato il nuovo precursore Fmoc-Asp(OEpe)-OH per l'inserimento di residui Asp nella Fmoc SPPS.
Caratteristiche e pregi
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Per saperne di più sul Fmoc-Asp(OEpe)-OH |
Il Fmoc-Asp(OEpe)-OH è una variante stericamente impedida del Fmoc-Asp(OtBu)-OH in cui l'ingombro sterico del gruppo t-butilico à accresciuto per omologazione lineare, per contribuire a schermare il gruppo aspartile β-carbonile riducendo, quindi, la formazione di sottoprodotti derivati dall'aspartimmide. In prove condotte utilizzando il noto peptide modello della tossina di scorpione II, sostituendo il Fmoc-Asp(OtBu)-OH o l'Fmoc-Asp(OMpe)-OH con Fmoc-Asp(OEpe)-OH per l'introduzione del residuo Asp, si è ottenuta una marcata riduzione della formazione di aspartimmide mediante trattamento con piperidina per 10 minuti a temperatura ambiente, passando da circa l'1,24% e lo 0,4% rispettivamente con Asp(OtBu) e Asp(OMpe), allo 0,13% per le sequenze Asp-Arg, e dall'1,65% e lo 0,5% rispettivamente con Asp(OtBu) e Asp(OMpe), allo 0,2% per le sequenze Asp-Asn (Figure 2 e 3, Tabella 1).
Per un peptide contenente 40 amminoacidi con Asp-Asn C-terminale, ciò si traduce in un incremento della resa per il prodotto dal 48% al 92% utilizzando Asp(OEpe) anziché Asp(OtBu). Il Fmoc-Asp(OEpe)-OH è risultato altrettanto efficace a 60 °C (Tabella 1, Figura 4).
Fig. 1: Formazione di aspartimmide, con i potenziali sottoprodotti.
Asp(OR)-(X)
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Condizioni |
Prodotto [area %] |
D/L-Aspartimmidi [area %] |
Piperididi [area %] |
Per ciclo [%]a |
|---|---|---|---|---|---|
tBu
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Piperidina a temp. amb. | 28,9 | 16,3 | 54,8 | 1,24 |
| Piperidina a 60 °C | 30,8 | 29,1 | 40,1 | 1,19 | |
Mpe
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Piperidina a temp. amb. | 64,2 | 6,2 | 26,8 | 0,4 |
| Piperidina a 60 °C | 63,5 | 16,9 | 19,6 | 0,45 | |
Epe
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Piperidina a temp. amb. | 87,8 | 3,6 | 8,6 | 0,13 |
| Piperidina a 60 °C | 85,4 | 7,8 | 6,8 | 0,16 | |
tBu
|
Piperidina a temp. amb. | 19,2 | 4,5 | 76,3 | 1,65 |
| Piperidina a 60 °C | 8,6 | 19,0 | 72,4 | 2,45 | |
Mpe
|
Piperidina a temp. amb. | 61,3 | 3,9 | 34,8 | 0,49 |
| Piperidina a 60 °C | 51,4 | 11,1 | 37,5 | 0,67 | |
Epe
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Piperidina a temp. amb. | 82,7 | 3,4 | 14,9 | 0,19 |
| Piperidina a 60 °C | 75,8 | 5,2 | 19,0 | 0,28 |
Tabella 1: Composizione dei prodotti grezzi ottenuti dalle peptidil-resine VKDXYI dopo trattamento con piperidina al 20% in DMF a temperatura ambiente e a 60 °C. aCalcolo del decadimento per ciclo k: decadimento di primo ordine: N = N0 • e-kt → k = -ln(N)/t ; N0 = 1; t = numero di cicli (100); N = area % del peptide desiderato. Sulla base di 10 minuti di trattamento con piperidina al 20% in DMF/ciclo a temperatura ambiente e 2 minuti di trattamento a 60 °C.
Figura 2: Profili UPLC dei peptidi grezzi clivati VKDNYI dopo trattamento con piperidina al 20% in DMF per 18 ore. 1: D/L aspartimmidi. 2: prodotto. 3: D/L piperididi. A: ottenuto con Fmoc-Asp(OtBu)-OH; B: ottenuto con Fmoc-Asp(OMpe)-OH; C: ottenuto con Fmoc-Asp(OEpe)-OH.
Figura 3: Profili UPLC dei peptidi grezzi clivati VKDRYI dopo trattamento con piperidina al 20% in DMF per 18 ore. 1: D/L aspartimmidi. 2: prodotto. 3: D/L piperididi. A: ottenuto con Fmoc-Asp(OtBu)-OH; B: ottenuto con Fmoc-Asp(OMpe)-OH; C: ottenuto con Fmoc-Asp(OEpe)-OH.
Figura 4: Profili UPLC dei peptidi grezzi clivati VKDRYI dopo trattamento con piperidina al 20% in DMF per 2 ore a 60 °C. 1: D/L aspartimmidi. 2: prodotto. 3: D/L piperididi. A: ottenuto con Fmoc-Asp(OtBu)-OH; B: ottenuto con Fmoc-Asp(OMpe)-OH; C: ottenuto con Fmoc-Asp(OEpe)-OH.