Espansione delle pseudoproline oltre Ser e Thr

I dipeptidi Fmoc-Xaa-Cys(Ψ^Dmp,^Hpro) -OH

• Prevenzione dell’epimerizzazione durante l’accoppiamento
• Risoluzione del problema dell’aggregazione
• Prevenzione dell’alchilazione durante il clivaggio
• Prodotti
• Riferimenti bibliografici

Fmoc-Ala-Cys (ΨDmp, Hpro) -OH	Fmoc-Leu-Cys (ΨDmp,Hpro) -OH
Fmoc-Lys(Boc)-Cys (ΨDmp, Hpro) -OH	Fmoc-Val-Cys (ΨDmp, Hpro) -OH

I dipeptidi della pseudoprolina di Mutter [1] sono strumenti eccezionali per potenziare l'efficienza della sintesi nella Fmoc SPPS. Il loro utilizzo comporta un miglioramento e una maggiore prevedibilità delle cinetiche di acilazione e deprotezione, da cui conseguono livelli superiori di purezza e solubilità dei prodotti grezzi, semplificazione della purificazione con HPLC e vantaggi nella resa, riducendo la necessità di ripetere le sintesi non riuscite. Hanno dimostrato di essere particolarmente efficaci nella sintesi dei peptidi difficili [2-5], dei peptidi lunghi/delle piccole proteine [6-13] e dei peptidi ciclici [14, 15], consentendo in molti casi di produrre peptidi altrimenti impossibili da realizzare. I derivati della pseudoprolina possono essere ottenuti a partire da Ser, Thr o Cys, tuttavia finora sono stati commercializzati solo quelli derivati da Ser e Thr. I nuovi dipeptidi della pseudoprolina di Novabiochem basati sulla cisteina espandono l’ambito dei precursori in grado di spezzare la struttura disponibili per la Fmoc SPPS.

Figura 1: Principi dell’utilizzo dei dipeptidi della pseudoprolina di derivazione cisteinica.

I dipeptidi della pseudoprolina basati su Cys si utilizzano esattamente come quelli derivati da Ser o Thr. È possibile accoppiarli con qualunque metodo di accoppiamento standard, come PyBOP/DIPEA o DIPCDI/Oxyma Pure, sostituendo con il dipeptide della pseudoprolina appropriato un residuo Cys insieme al residuo aminoacidico precedente nella sequenza peptidica (Figura 1). In presenza di TFA l’anello tiazolidinico è labile, per cui con il clivaggio e la deprotezione si rigenera il peptide contenente cisteina della sequenza nativa.

Le pseudoproline cisteiniche si possono utilizzare in combinazione con pseudoproline standard e dipeptidi Dmb. Il posizionamento a intervalli regolari nella sequenza peptidica, alla distanza di 6 residui uno dall’altro, di questi derivati in grado di spezzare la struttura ha dimostrato di essere un approccio molto efficace per la sintesi di peptidi lunghi e amiloidogenici.

Prevenzione dell’epimerizzazione durante l’accoppiamento

Si sa che durante l’accoppiamento la cisteina protetta con tritile va incontro alla racemizzazione, soprattutto se si utilizzano metodi attivati con basi. Le pseudoproline derivate dalla cisteina presentano invece una straordinaria stabilità chirale, come dimostrano i risultati riportati nella Figura 2. H-Lys-Cys-Phe-Pro-Glu-Tyr-Thr-Pro-Asn-Phe-OH (EGF (36-45)) preparato con attivazione con TBTU/DIPEA utilizzando Fmoc-Cys(Trt)-OH conteneva il 3,7% di D-Cys (Tabella 1, A), mentre utilizzando Fmoc-Lys(Boc)-Ser(ΨDmp,Hpro)-OH è stato prodotto solamente lo 0,4% di D-Cys (Tabella 1, B).

Figura 2: Profilo HPLC di H-Lys-Cys-Phe-Pro-Glu-Tyr-Thr-Pro-Asn-Phe-OH grezzo preparato con attivazione con TBTU/DIPEA utilizzando Fmoc-Cys(Trt)-OH (in alto) e Fmoc-Lys(Boc)-Cys(ΨDmp,Hpro)-OH (in basso).

Torna su

Risoluzione del problema dell’aggregazione

La capacità dei derivati delle pseudoproline ottenuti da Ser e Thr di interrompere l’aggregazione durante l’assemblaggio dei peptidi è stata ampiamente dimostrata. Si ritiene che l’anello dimetilossazolidinico della pseudoprolina, favorendo una conformazione con legame cis-ammidico, induca una torsione della catena peptidica. Si sa che le pseudoproline derivate dalla cisteina e dalla dimetossibenzaldeide sono meno efficaci nel promuovere una conformazione cis-ammidica e quindi ci si può attendere che siano meno efficienti nell’impedire l’aggregazione.

Per accertare la verità di quanto sopra, sono stati preparati analoghi del peptide difficile emoagglutinina del virus dell’influenza, utilizzando Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Ala-Ser(Ψ^Me,^Mepro)-OH o Fmoc-Ala-Cys(Ψ^Dmp,^Hpro)-OH. La Figura 3 riporta i profili HPLC dei peptidi grezzi ottenuti da tali sintesi. Come previsto, il peptide preparato utilizzando Fmoc-Ser(tBu)-OH presentava una elevata eterogeneità. Viceversa, le purezze degli analoghi preparati utilizzando i precursori di entrambe le pseudoproline sono risultate eccellenti, indicando che i dipeptidi della pseudoprolina derivati da Cys sono efficaci quanto quelli derivati da Ser o Thr ai fini dell’inibizione dell’aggregazione (Figura 3)

Figura 3: Profili HPLC di H-Met-Glu-Asp-Ser-Thr-Tyr-Tyr-Lys-Ala-Ser-Lys-Gly-Cys-NH₂ grezzo preparato con Fmoc-Ser(tBu)-OH (in alto) e Fmoc-Ala-Ser(Ψ^Me,^Mepro)-OH (al centro), e di H-Met-Glu-Asp-Ser-Thr-Tyr-Tyr-Lys-Ala-Cys-Lys-Gly-Cys-NH₂ grezzo preparato con Fmoc-Ala-Cys(Ψ^Dmb,^Hpro)-OH (in basso).

Torna su

Prevenzione dell’alchilazione durante il clivaggio

L’apertura dell’anello dei residui Cys(ΨDmp,Hpro) con il TFA rilascia dimetossibenzaldeide reattiva. Il clivaggio del peptide modello EGF con il cocktail standard TFA/TIPS/acqua ha fornito due sottoprodotti principali: un peptide dimerico derivato dalla dimetossibenzaldeide e un addotto della dimetossibenzaldeide.

Aggiungendo l’EDT al cocktail è stato possibile eliminare entrambi i sottoprodotti ottenendo un prodotto puro. Escludendo il TIPS dal cocktail è stato possibile ottenere prodotti contenenti dimetossibenzaldeide libera. Perciò il clivaggio dei peptidi contenenti residui Cys(Dmb,Hpro) deve essere effettuato con TFA/TIPS/acqua/EDT (Tabella 1).

Figura 4: Profili HPLC di H-Lys(Boc)-Cys(Ψ^Dmb,^Hpro)-Phe-Pro-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Pro-Asn(Trt)-Phe-Wang grezzo clivato con TFA/TIPS/acqua (95:2,5/2,5) (in alto), con TFA/EDT/acqua (95:2,5/2,5) (al centro) e con TFA/TIPS/acqua/EDT (92,5:2,5/2,5/2,5) (in basso).

Torna su

Prodotti

Riferimenti bibliografici

1. a) T. Haack & M. Mutter (1992) Tetrahedron Lett., 33, 1589; b) M. Mutter, et al. (1995) Pept. Res., 8, 145.
2. P. White, et al. in “Peptides 1998, Proc. of 25th European Peptide Symposium”, Budapest, Akadémiai Kiadó, 1998, pp. 120.
3. C. Hyde, et al. (1994) Int. J. Peptide Protein Res., 43, 431.
4. R. von Eggelkraut-Gottanka, et al. (2003) ChemBioChem, 4, 425.
5. F. Shabanpoor, et al. (2007) J. Pept. Sci., 13, 113.
6. a) P. White, et al. (2004) J. Pept. Sci., 10, 18; b) P. White, et al. (2003) Biopolymers, 71, 338.
7. F. García-Martín, et al. (2006) Bipolymers, 84, 566.
8. S. Abu-Baker & G. A. Lorigan (2006) Biochemistry, 45, 13312.
9. V. Goncalves, et al. (2009) J. Pept. Sci., 15, 417.
10. F. El Oualid, et al. (2010) Angew. Chem. Int. Ed., 49, 10149.
11. S. N. Bavikar, et al. (2012) Angew. Chem. Int. Ed., 51, 758.
12. P. Nagorny, et al. (2012) Angew. Chem. Int. Ed., 51, 975.
13. C. Yves-Marie, et al. (2010) J. Pept. Sci., 16, 98.
14. A. Ehrlich, et al. (1996) J. Org. Chem., 61, 8831.
15. N. Schmiedeberg & H. Kessler (2002) Org. Lett., 4, 59.

Torna su