Extension des pseudoprolines au-delà de Ser et Thr

Présentation des dipeptides Fmoc-Xaa-Cys(Ψ^Dmp,^Hpro) -OH

• Prévention de l'épimérisation lors du couplage
• Surmonter la formation d'agrégats
• Prévention de l'alkylation lors du clivage
• Produits
• Références bibliographiques

Fmoc-Ala-Cys (ΨDmp, Hpro) -OH	Fmoc-Leu-Cys (ΨDmp,Hpro) -OH
Fmoc-Lys(Boc)-Cys (ΨDmp, Hpro) -OH	Fmoc-Val-Cys (ΨDmp, Hpro) -OH

Les dipeptides pseudoproline de Mutter [1] sont de nouveaux outils puissants pour favoriser l'efficacité de la synthèse par SPPS Fmoc. Leur utilisation entraîne une meilleure cinétique d'acylation et de déprotection, qui se déroulent de manière plus prévisible, ce qui améliore la pureté et la solubilité des produits bruts, facilite la purification par CLHP et augmente le rendement, tout en diminuant le nombre d'échecs de synthèse. Ils se sont avérés particulièrement efficaces dans la synthèse des peptides difficiles [2 - 5], des longs peptides ou petites protéines [6 - 13] et des peptides cycliques [14, 15], ce qui dans de nombreux cas rend possible la production de peptides qui n'auraient pas été possibles par d'autre méthodes. Les dérivés de pseudoproline peuvent provenir de Ser, Thr ou Cys. Cependant, seuls les dérivés de Ser et Thr ont été disponibles dans le commerce jusqu'à présent. Les dipeptides pseudoproline à base de cystéine offerts par Novabiochem étendent la gamme de building blocks perturbant les structures disponibles pour la Fmoc SPPS.

Figure 1 : principes de l'utilisation des dipeptides pseudoproline à base de cystéine.

Les dipeptides pseudoproline à base de cystéine s'utilisent exactement de la même manière que ceux dérivés de Ser ou Thr. Ils peuvent être couplés à l'aide de n'importe quelle méthode de couplage standard, telle que PyBOP/DIPEA ou DIPCDI/Oxyma Pure, en substituant un résidu de Cys et le résidu d'acide aminé précédent de la séquence du peptide avec le dipeptides pseudoproline approprié (figure 1). Le noyau thiazolidine est labile en présence d'acide trifluoroacétique (TFA). Le peptide de séquence native contenant le groupe cystéinyle peut ainsi être régénéré par clivage et déprotection.

Les cystéine pseudoprolines peuvent être utilisées en association avec les dipeptides standard pseudoprolines et Dmb. Le placement de ces dérivés perturbant les structures environ tous les 6 résidus à intervalles réguliers dans la séquence peptidique est une approche très efficace pour la synthèse de peptides longs et amyloïdogéniques.

Prévention de l'épimérisation lors du couplage

Les cystéines à protection trityle sont susceptibles de subir une racémisation en cours de couplage, et ce particulièrement si des méthodes d'activation par bases sont utilisées. Par contre, les pseudoprolines dérivées de la cystéine présentent une excellente stabilité chirale, comme illustré dans la figure  2. Le peptide H-Lys-Cys-Phe-Pro-Glu-Tyr-Thr-Pro-Asn-Phe-OH (EGF (36-45)) préparé par activation au TBTU/DIPEA à l'aide de Fmoc-Cys(Trt)-OH contenait 3,7 % de D-Cys (Tableau 1A), alors que l'utilisation de Fmoc-Lys(Boc)-Ser(ΨDmp,Hpro)-OH n'a produit que 0,4 % de D-Cys (Tableau 1B).

Figure 2  : Profile CLHP du peptide brut H-Lys-Cys-Phe-Pro-Glu-Tyr-Thr-Pro-Asn-Phe-OH préparé par activation au TBTU/DIPEA à l'aide de Fmoc-Cys(Trt)-OH (en haut) et de Fmoc-Lys(Boc)-Cys(ΨDmp,Hpro)-OH (en bas).

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Surmonter la formation d'agrégats

La capacité des pseudoprolines dérivées de Ser et Thr d'empêcher la formation d'agrégats lors de l'assemblage de peptides a été amplement documentée On pense que le noyau diméthyloxazolidine de la pseudoproline forme un coude dans la chaîne peptidique en favorisant la conformation du lien cis-amide. Les pseudoprolines dérivées de cystéine et de diméthoxybenzaldéhyde sont moins efficaces pour favoriser la formation d'un de conformation lien cis-amide, ce qui suggère qu'elles pourraient être moins efficaces à empêcher la formation d'agrégats.

Pour déterminer si c'est bien le cas, des analogues du peptide d'hémagglutinine du virus influenza, difficile à synthétiser, ont été préparés en utilisant soit Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Ala-Ser(Ψ^Me,^Mepro)-OH ou Fmoc-Ala-Cys(Ψ^Dmp,^Hpro)-OH. La figure 3 illustre les profils CLHP des peptides bruts obtenus au cours de ces synthèses. Comme prévu, le peptide préparé en utilisant Fmoc-Ser(tBu)-OH était très hétérogène. Par contre la pureté des analogues préparés avec les deux building blocks de pseudoproline était excellente, ce qui montre que les dipeptides pseudoproline dérivés de Cys sont aussi efficaces que ceux dérivés de Ser ou Thr pour ce qui est d'inhiber la formation d'agrégats (figure 3).

Figure 3 : Profils CLHP de peptides bruts H-Met-Glu-Asp-Ser-Thr-Tyr-Tyr-Lys-Ala-Ser-Lys-Gly-Cys-NH₂ préparés avec Fmoc-Ser(tBu)-OH (en haut) et Fmoc-Ala-Ser(Ψ^Me,^Mepro)-OH (au milieu), et peptide brut H-Met-Glu-Asp-Ser-Thr-Tyr-Tyr-Lys-Ala-Cys-Lys-Gly-Cys-NH₂ préparés avec Fmoc-Ala-Cys(Ψ^Dmb,^Hpro)-OH (en bas).

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Prévention de l'alkylation lors du clivage

La rupture du noyau des résidus Cys(ΨDmp,Hpro) par l'acide trifluoroacétique (TFA) libère de la diméthoxybenzaldéhyde réactive. Le clivage du peptide modèle EGF avec le cocktail standard TFA/TIPS/eau a donné deux sous-produits principaux : un peptide dimère dérivé de la diméthoxybenzaldéhyde et un adduit de diméthoxybenzaldéhyde.

L'ajout d'EDT au cocktail a éliminé les deux sous-produits et fourni un produit plus pur. L'omission de TIPS du cocktail a donné des produits contenant de la diméthoxybenzaldéhyde libre. Ces résultats indiquent que les peptides contenant des résidus Cys(Dmb,Hpro) doivent être clivés en présence de TFA/TIPS/eau/EDT (tableau 1).

Figure 4 : Profils CLHP de peptides bruts H-Lys(Boc)-Cys(Ψ^Dmb,^Hpro)-Phe-Pro-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Pro-Asn(Trt)-Phe-Wang clivé en présence de TFA/TIPS/water (95:2.5/2.5) (en haut), TFA/EDT/water (95:2.5/2.5) (au milieu) et TFA/TIPS/water/EDT (92.5:2.5/2.5/2.5) (en bas).

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Produits

Références bibliographiques

1. a) T. Haack & M. Mutter (1992) Tetrahedron Lett., 33, 1589; b) M. Mutter, et al. (1995) Pept. Res., 8, 145.
2. P. White, et al. in “Peptides 1998, Proc. of 25th European Peptide Symposium”, Budapest, Akadémiai Kiadó, 1998, pp. 120.
3. C. Hyde, et al. (1994) Int. J. Peptide Protein Res., 43, 431.
4. R. von Eggelkraut-Gottanka, et al. (2003) ChemBioChem, 4, 425.
5. F. Shabanpoor, et al. (2007) J. Pept. Sci., 13, 113.
6. a) P. White, et al. (2004) J. Pept. Sci., 10, 18; b) P. White, et al. (2003) Biopolymers, 71, 338.
7. F. García-Martín, et al. (2006) Bipolymers, 84, 566.
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9. V. Goncalves, et al. (2009) J. Pept. Sci., 15, 417.
10. F. El Oualid, et al. (2010) Angew. Chem. Int. Ed., 49, 10149.
11. S. N. Bavikar, et al. (2012) Angew. Chem. Int. Ed., 51, 758.
12. P. Nagorny, et al. (2012) Angew. Chem. Int. Ed., 51, 975.
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14. A. Ehrlich, et al. (1996) J. Org. Chem., 61, 8831.
15. N. Schmiedeberg & H. Kessler (2002) Org. Lett., 4, 59.

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