Extendiendo las pseudoprolinas más allá de la Ser y la Thr

Presentación de los dipéptidos Fmoc-Xaa-Cys(Ψ^Dmp,^Hpro) -OH

• Prevención de la epimerización durante el acoplamiento
• Evitando la agregación
• Prevención de la alquilación durante el desanclaje
• Productos
• Referencias bibliográficas

Fmoc-Ala-Cys (ΨDmp, Hpro) -OH	Fmoc-Leu-Cys (ΨDmp,Hpro) -OH
Fmoc-Lys(Boc)-Cys (ΨDmp, Hpro) -OH	Fmoc-Val-Cys (ΨDmp, Hpro) -OH

Los dipéptidos pseudoprolina de Mutter [1] son potentes herramientas para mejorar la eficiencia sintética en la SPPS Fmoc. Su uso induce cinéticas de acilación y de desprotección mejores y más predecibles, lo que da lugar a mayores purezas y solubilidades de los productos en bruto, una purificación mediante HPLC más fácil y mejores rendimientos, con menor necesidad de repetición de síntesis fallidas. Se han demostrado particularmente eficaces en la síntesis de péptidos intratables [2 - 5], péptidos largos o proteínas pequeñas [6 - 13] y péptidos cíclicos [14, 15], permitiendo en muchos casos la producción de péptidos que, de lo contrario, no podrían crearse. Los derivados pseudoprolínicos pueden obtenerse a partir de Ser, Thr o Cys, sin embargo, hasta ahora sólo se ha dispuesto comercialmente de los basados en la Ser y la Thr. Los nuevos dipéptidos pseudoprolina de Novabiochem basados en la cisteína amplían el alcance de las unidades estructurales desestabilizantes de la estructura de los que se dispone para SPPS Fmoc.

Figura 1: Principios de utilización de los dipéptidos cisteinil pseudoprolina.

Los dipéptidos de pseudoprolina basados en la Cys se utilizan exactamente igual que los procedentes de Ser o Thr. Pueden acoplarse utilizando cualquier método de acoplamiento convencional, como PyBOP/DIPEA o DIPCDI/Oxyma Pure, sustituyendo un residuo de Cys, junto con el resto aminoacídico precedente en la secuencia peptídica, por el dipéptido pseudoprolina apropiado (figura 1). El anillo tiazolidínico es lábil al TFA, de modo que el péptido que contiene la secuencia cisteinil- nativa se regenera mediante desanclaje y desprotección.

Las pseudoprolinas de cisteína pueden utilizarse en combinación con las pseudoprolinas convencionales y los dipéptidos Dmb. La colocación de estos derivados desestabilizantes de la estructura a intervalos regulares aproximadamente cada 6 residuos en la secuencia peptídica ha demostrado ser un enfoque en extremo eficaz para la síntesis de péptidos largos y amiloidógenos.

Prevención de la epimerización durante el acoplamiento

Se sabe que la cisteína protegida con tritilo experimenta racemización durante el acoplamiento, en particular si se utilizan métodos activados que requieren una base. Por el contrario, las pseudoprolinas derivadas de la cisteína tienen una excelente estabilidad quiral, como ilustran los resultados mostrados en la figura 2. La H-Lys-Cys-Phe-Pro-Glu-Tyr-Thr-Pro-Asn-Phe-OH (EGF (36-45)) preparada mediante activación con TBTU/DIPEA utilizando Fmoc-Cys(Trt)-OH contenía un 3,7 % de D-Cys Tabla 1, A), mientras que utilizando Fmoc-Lys(Boc)-Ser(ΨDmp,Hpro)-OH, sólo se generó un 0,4 % de D-Cys ( (tabla 1, B).

Figura 2: perfil de HPLC de la H-Lys-Cys-Phe-Pro-Glu-Tyr-Thr-Pro-Asn-Phe-OH en bruto preparada mediante activación con TBTU/DIPEA (arriba) utilizando Fmoc-Cys(Trt)-OH y (abajo) utilizando Fmoc-Lys(Boc)-Cys(ΨDmp,Hpro)-OH.

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Evitando la agregación

La capacidad de las pseudoprolinas derivadas de Ser y Thr para alterar la agregación durante el ensamblaje del péptido está bien demostrada. Se piensa que el anillo de dimetiloxazolidina de la pseudoprolina impone un pliegue en la cadena peptídica porque favorece la conformación cis del enlace amida. Las pseudoprolinas derivadas de la cisteína y el dimetoxibenzaldehído se sabe que son menos eficaces en la promoción de la conformación amida cis y, por consiguiente, cabría esperar que evitaran la agregación con menos eficacia.

Para determinar si esto es así realmente, se prepararon análogos del difícil péptido hemaglutinina del virus de la gripe utilizando Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Ala-Ser(Ψ^Me,^Mepro)-OH o Fmoc-Ala-Cys(Ψ^Dmp,^Hpro)-OH. En la figura 3 se muestran los perfiles de HPLC de los péptidos en bruto obtenidos a partir de esas síntesis. Como cabía esperar, el péptido preparado utilizando Fmoc-Ser(tBu)-OH era muy heterogéneo. Por el contrario, las purezas de los análogos preparados utilizando como unidad estructural pseudoprolina, fueron excelentes, lo que indica que los dipéptidos pseudoprolina derivados de Cys inhiben la agregación con igual eficacia que los procedentes de Ser o Thr (figura 3).

Figura 3: perfiles de HPLC de la H-Met-Glu-Asp-Ser-Thr-Tyr-Tyr-Lys-Ala-Ser-Lys-Gly-Cys-NH₂en bruto preparada con (izquierda) Fmoc-Ser(tBu)-OH y (centro) Fmoc-Ala-Ser(Ψ^Me,^Mepro)-OH, y (derecha) H-Met-Glu-Asp-Ser-Thr-Tyr-Tyr-Lys-Ala-Cys-Lys-Gly-Cys-NH₂ en bruto preparada con Fmoc-Ala-Cys(Ψ^Dmb,^Hpro)-OH.

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Prevención de la alquilación durante el desanclaje

La apertura del anillo de los restos Cys(ΨDmp,Hpro) con TFA libera el dimetoxibenzaldehído reactivo. El desanclaje del péptido modelo EGF con la mezcla TFA/TIPS/agua convencional dio lugar a dos productos secundarios principales: un dímero peptídico derivado del dimetoxibenzaldehído y un aducto del dimetoxibenzaldehído.

La adición de EDT a la mezcla eliminó los dos productos secundarios y dio lugar a un producto limpio. Si se eliminaba el TIPS de la mezcla se obtenían productos que contenían dimetoxibenzaldehído libre. Por consiguiente, los péptidos que contienen restos Cys(Dmb,Hpro) deben ser desanclados con TFA/TIPS/agua/EDT (tabla 1).

Figura 4: perfiles de HPLC de la H-Lys(Boc)-Cys(Ψ^Dmb,^Hpro)-Phe-Pro-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Pro-Asn(Trt)-Phe-Wang en bruto desanclada con (izquierda) TFA/TIPS/agua (95:2.5/2.5), (centro) TFA/EDT/agua (95:2.5/2.5) y (derecha) TFA/TIPS/agua/EDT (92.5:2.5/2.5/2.5).

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Productos

Referencias bibliográficas

1. a) T. Haack & M. Mutter (1992) Tetrahedron Lett., 33, 1589; b) M. Mutter, et al. (1995) Pept. Res., 8, 145.
2. P. White, et al. in “Peptides 1998, Proc. of 25th European Peptide Symposium”, Budapest, Akadémiai Kiadó, 1998, pp. 120.
3. C. Hyde, et al. (1994) Int. J. Peptide Protein Res., 43, 431.
4. R. von Eggelkraut-Gottanka, et al. (2003) ChemBioChem, 4, 425.
5. F. Shabanpoor, et al. (2007) J. Pept. Sci., 13, 113.
6. a) P. White, et al. (2004) J. Pept. Sci., 10, 18; b) P. White, et al. (2003) Biopolymers, 71, 338.
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14. A. Ehrlich, et al. (1996) J. Org. Chem., 61, 8831.
15. N. Schmiedeberg & H. Kessler (2002) Org. Lett., 4, 59.

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