Produkt im Blickpunkt: Fmoc-Asp(OEpe)-OH |
Sterisch gehinderte Variante von Fmoc-Asp(OtBu)-OH
Trotz vieler Fortschritte in den letzten Jahren ist die Aspartimidbildung besonders bei der Synthese von langen Peptiden immer noch problematisch, da das wiederholte Einwirken von Piperidin auf die wachsende Peptidkette zur Anhäufung von Aspartimid-ähnlichen Nebenprodukten führt (Abb. 1). Während in vielen Fällen die durch diese Nebenreaktion gebildeten Aspartimide sowie α- und β-Piperidide leicht durch HPLC von dem Zielpeptid getrennt werden können, sind die β-Aspartylpeptide und epimerisierte α-Aspartylpeptide beinahe unmöglich zu entfernen, da diese häufig dieselbe Retentionszeit aufweisen wie das Zielpeptid. Außerdem sind diese Nebenprodukte schwer nachzuweisen, da sie dieselbe Masse wie das Zielpeptid aufweisen.
Daher ist die Einführung von Synthesestrategien zur Minimierung der Aspartimidbildung eine Voraussetzung für die Herstellung von homogenen aspartylhaltigen Peptiden in guter Ausbeute. Aus diesem Grund hat Novabiochem den neuen Baustein Fmoc-Asp(OEpe)-OH zur Einführung von Asp-Resten bei der Fmoc-SPPS entwickelt.
Merkmale & Vorteile
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Erfahren Sie mehr über Fmoc-Asp(OEpe)-OH |
Fmoc-Asp(OEpe)-OH ist eine sterisch gehinderte Variante von Fmoc-Asp(OtBu)-OH, bei der die sterische Größe der t-Butylgruppe durch lineare Homologisierung erhöht wird, um die Aspartyl-β-Carbonylgruppe abzuschirmen und so die Bildung von aus Aspartimid abgeleiteten Nebenprodukten zu reduzieren. In Tests mit dem gut etablierten Skorpiontoxin-II-Modellpeptid zeigte sich, dass die Verwendung von Fmoc-Asp(OEpe)-OH anstelle von Fmoc-Asp(OtBu)-OH oder Fmoc-Asp(OMpe)-OH zur Einführung des Asp-Restes das Ausmaß der Aspartimidbildung deutlich reduzierte, nämlich bei 10-minütiger Piperidinbehandlung bei Raumtemperatur von 1,24 % bzw. 0,4 % mit Asp(tBu) bzw. Asp(OMpe) auf nur 0,13 % für Asp-Arg-Sequenzen, und von 1,65 % bzw. 0,5 % für Asp(OtBu) bzw. Asp(OMpe) auf 0,2% für Asp-Asn-Sequenzen (Abb. 2 und 3, Tab. 1).
Für Peptide, die 40 Aminosäuren mit C-terminaler Asp-Asn-Sequenz enthalten, bedeutet dies eine Steigerung der Produktausbeute von 48 % auf 92 %, wenn Asp(OEpe) anstelle von Asp(OtBu) verwendet wird. Es zeigte sich, dass die Verwendung von Fmoc-Asp(OEpe)-OH bei 60 °C genauso wirksam war (Tab. 1, Abb. 4).
Abb. 1: Aspartimidbildung. Gezeigt sind potenzielle Nebenprodukte.
Asp(OR)-(X)
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Bedingungen |
Produkt [Fläche %] |
D/L-Aspartimide [Fläche %] |
Piperide [Fläche %] |
Pro Zyklus [%]a |
|---|---|---|---|---|---|
tBu
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Piperidin bei RT | 28,9 | 16,3 | 54,8 | 1,24 |
| Piperidin bei 60 °C | 30,8 | 29,1 | 40,1 | 1,19 | |
Mpe
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Piperidin bei RT | 64,2 | 6,2 | 26,8 | 0,4 |
| Piperidin bei 60 °C | 63,5 | 16,9 | 19,6 | 0,45 | |
Epe
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Piperidin bei RT | 87,8 | 3,6 | 8,6 | 0,13 |
| Piperidin bei 60 °C | 85,4 | 7,8 | 6,8 | 0,16 | |
tBu
|
Piperidin bei RT | 19,2 | 4,5 | 76,3 | 1,65 |
| Piperidin bei 60 °C | 8,6 | 19,0 | 72,4 | 2,45 | |
Mpe
|
Piperidin bei RT | 61,3 | 3,9 | 34,8 | 0,49 |
| Piperidin bei 60 °C | 51,4 | 11,1 | 37,5 | 0,67 | |
Epe
|
Piperidin bei RT | 82,7 | 3,4 | 14,9 | 0,19 |
| Piperidin bei 60 °C | 75,8 | 5,2 | 19,0 | 0,28 |
Tab. 1: Zusammensetzung von Rohprodukten, erhalten von VKDXYI-Peptidylharzen nach Behandlung mit 20 % Piperidin in DMF bei Raumtemperatur bzw. 60 °C. a: Errechnete Zersetzung pro Zyklus k: Zersetzung erster Ordnung: N = N0 • e-kt → k = -ln(N)/t ; N0 = 1; t = Anzahl der Zyklen (100); N = Fläche % des Zielpeptids. Basierend auf 10-minütiger Behandlung mit 20 % Piperidin in DMF/Zyklus bei Raumtemperatur und 2-minütiger Behandlung bei 60 °C.
Abb. 2: UPLC-Profile von rohen gespaltenen VKDNYI-Peptiden nach Behandlung mit 20 % Piperidin in DMF für 18 h. 1: D/L-Aspartimide. 2: Produkt. 3: D/L-Piperidide. A: hergestellt mit Fmoc-Asp(OtBu)-OH; B: hergestellt mit Fmoc-Asp(OMpe)-OH; C: hergestellt mit Fmoc-Asp(OEpe)-OH.
Abb. 3. UPLC-Profile von rohen gespaltenen VKDRYI-Peptiden nach Behandlung mit 20 % Piperidin in DMF für 18 h. 1: D/L-Aspartimide. 2: Produkt. 3: D/L-Piperidide. A: hergestellt mit Fmoc-Asp(OtBu)-OH; B: hergestellt mit Fmoc-Asp(OMpe)-OH; C: hergestellt mit Fmoc-Asp(OEpe)-OH.
Abb. 4: UPLC-Profile von rohen gespaltenen VKDRYI-Peptiden nach Behandlung mit 20 % Piperidin in DMF für 2 h bei 60 °C. 1: D/L-Aspartimide. 2: Produkt. 3: D/L-Piperidide. A: hergestellt mit Fmoc-Asp(OtBu)-OH; B: hergestellt mit Fmoc-Asp(OMpe)-OH; C: hergestellt mit Fmoc-Asp(OEpe)-OH.