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Neue Basis für Pseudoproline (zusätzlich zu Ser und Thr)

Fmoc-Xaa-Cys(ΨDmp,Hpro)-OH-Dipeptide

Fmoc-Ala-Cys
Fmoc-Leu-Cys
Fmoc-Ala-Cys (ΨDmp, Hpro) -OH Fmoc-Leu-Cys (ΨDmp,Hpro) -OH
Fmoc-Lys(Boc)-Cys
Fmoc-Val-Cys
Fmoc-Lys(Boc)-Cys (ΨDmp, Hpro) -OH Fmoc-Val-Cys (ΨDmp, Hpro) -OH

Die Pseudoprolin-Dipeptide nach Mutter [1] sind leistungsstarke Werkzeuge zur Verbesserung der Syntheseleistung bei der Fmoc-SPPS. Mit ihrer Hilfe lässt sich die Kinetik von Acetylierung und Entschützung verbessern und besser berechnen. Dies führt zu einer höheren Reinheit und höheren Löslichkeit der Rohprodukte, vereinfacht die HPLC-Reinigung und verbessert Ausbeute und Erfolgsquote von Peptidsynthesen. Pseudoprolin-Dipeptide haben sich als besonders wirksam bei der Synthese schwieriger Peptide [2 - 5], langer/kleiner Proteine [6 - 13], und zyklischer Peptide [14, 15] erwiesen. In vielen Fällen ermöglichten sie die Herstellung von Peptiden, die auf andere Weise nicht synthetisiert werden konnten. Pseudoprolin-Derivate können von Ser, Thr oder Cys abgeleitet sein, doch waren bisher nur die auf Ser und Thr basierenden Dipeptide im Handel erhältlich. Die neuen cysteinbasierten Pseudoprolin-Dipeptide von Novabiochem erweitern den Anwendungsbereich der strukturstörenden Bausteine, die für die Fmoc-SPPS erhältlich sind.

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Abbildung 1: Prinzip der Anwendung von Cysteinyl-Pseudoprolin-Dipeptiden.

Cys-basierte Pseudoprolin-Dipeptide werden in genau der gleichen Weise eingesetzt, wie die von Ser oder Thr abgeleiteten Dipeptide. Sie können mithilfe eines beliebigen gängigen Kupplungsverfahrens, wie PyBOP/DIPEA oder DIPCDI/Oxyma Pure, gekuppelt werden. Dabei wird ein Cys-Rest zusammen mit dem in der Peptidsequenz vorangehenden Aminosäurerest mit dem geeigneten Pseudoprolin-Dipeptid ausgetauscht (Abb. 1) Der Thiazolidin-Ring ist TFA-labil, sodass durch Abspaltung der Schutzgruppe das cysteinylhaltige Peptid mit nativer Sequenz wiederhergestellt wird.

Cystein-Pseudoproline können in Kombination mit den gängigen Pseudoprolinen und Dmb-Dipeptiden verwendet werden. Bei der Synthese langer und amyloidogener Peptide hat es sich als besonders wirkungsvoll erwiesen, die strukturstörenden Derivate in regelmäßigen Abständen ca. 6 Aminosäurereste voneinander entfernt in der Peptidsequenz zu positionieren.

Verhinderung der Epimerisierung während der Kupplung

Es ist bekannt, dass Trityl-geschütztes Cystein während der Kupplung eine Racemisierung durchläuft, besonders, wenn basenaktivierte Verfahren verwendet werden. Wie die in Abbildung 2 gezeigten Ergebnisse zeigen, weisen von Cystein abgeleitete Pseudoproline dagegen eine hervorragende chirale Stabilität auf. H-Lys-Cys-Phe-Pro-Glu-Tyr-Thr-Pro-Asn-Phe-OH (EGF (36–45)), hergestellt mithilfe von TBTU/DIPEA-Aktivierung und Fmoc-Cys(Trt)-OH, enthielt 3,7 % D-Cys, Tabelle 1, A). Bei Verwendung von Fmoc-Lys(Boc)-Ser(ΨDmp,Hpro)-OH hingegen wurde nur 0,4 % D-Cys gebildet (Tabelle 1, B).

EGF

Peptidreinheit
(% Fläche)
% D-Cys
A 81 3,9
B. TFA/H2O/TIPS 47 0,4
B. TFA/H2O/EDT 76 0,4
B. TFA/H2O/TIPS/EDT 81 0,4

Tabelle 1:
Reinheit und D-Cys-Gehalt von EGF (36–45), hergestellt mit Fmoc-Cys(Trt)-OH (A) bzw. Fmoc-Lys(Boc)-Cys(ΨDmp,Hpro)-OH (B).
HPLC-Profil von H-Lys-Cys-Phe-Pro-Glu-Tyr-Thr-Pro-Asn-Phe-OH-Rohpeptid
Abbildung 2: HPLC-Profil von H-Lys-Cys-Phe-Pro-Glu-Tyr-Thr-Pro-Asn-Phe-OH-Rohpeptid, hergestellt mithilfe von TBTU/DIPEA-Aktivierung und Fmoc-Cys(Trt)-OH (oben) bzw. Fmoc-Lys(Boc)-Cys(ΨDmp,Hpro)-OH (unten).

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Vermeidung der Aggregatbildung

Die Eigenschaft der von Ser und Thr abgeleiteten Pseudoproline, die Bildung von Aggregaten während der Peptid-Assemblierung zu stören, ist vielfach belegt. Man nimmt an, dass der Dimethyloxazolidin-Ring des Pseudoprolins einen Knick in der Peptidkette verursacht, weil er eine Peptidbindung in cis-Konformation bevorzugt. Von Cystein und Dimethoxybenzaldehyd abgeleitete Pseudoproline begünstigen die cis-Konformation der Peptidbindung bekanntermaßen weniger stark, sodass man annehmen könnte, dass sie die Bildung von Aggregaten weniger wirksam verhindern.

Um zu prüfen, ob dies tatsächlich der Fall ist, wurden Analoga des schwierig zu synthetisierenden Hämagglutinin-Peptids des Influenzavirus mithilfe von Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Ala-Ser(ΨMe,Mepro)-OH oder Fmoc-Ala-Cys(ΨDmp,Hpro)-OH hergestellt. Abbildung 3 zeigt die HPLC-Profile der aus diesen Synthesen gewonnenen Rohpeptide. Wie erwartet, war das mithilfe von Fmoc-Ser(tBu)-OH hergestellte Peptid äußerst heterogen. Dagegen waren die mithilfe der beiden Pseudoprolin-Bausteine hergestellten Analoga von ausgezeichneter Reinheit. Das zeigt, dass die von Cys abgeleiteten Pseudoprolin-Dipeptide die Aggregatbildung genauso wirksam hemmen wie jene, die von Ser oder Thr abgeleitet sind (Abbildung 3).

HPLC-Profile von H-Met-Glu-Asp-Ser-Thr-Tyr-Tyr-Lys-Ala-Ser-Lys-Gly-Cys-NH2- Rohpeptiden
Abbildung 3: HPLC-Profile von H-Met-Glu-Asp-Ser-Thr-Tyr-Tyr-Lys-Ala-Ser-Lys-Gly-Cys-NH2-Rohpeptid, hergestellt mit Fmoc-Ser(tBu)-OH (oben) oder Fmoc-Ala-Ser(ΨMe,Mepro)-OH (Mitte) sowie H-Met-Glu-Asp-Ser-Thr-Tyr-Tyr-Lys-Ala-Cys-Lys-Gly-Cys-NH2-Rohpeptid, hergestellt mit Fmoc-Ala-Cys(ΨDmb,Hpro)-OH (unten).

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Verhinderung der Alkylierung während der Spaltung

Die Ringöffnung mit TFA setzt bei Cys(ΨDmp,Hpro)-Resten reaktives Dimethoxybenzaldehyd frei. Die Spaltung des EGF-Modellpeptids mit dem üblichen TFA/TIPS/Wasser-Gemisch lieferte zwei wesentliche Nebenprodukte: ein von Dimethoxybenzaldehyd abgeleitetes Peptid-Dimer und ein Dimethoxybenzaldehyd-Addukt.

Der Zusatz von EDT zu dem Gemisch verhinderte die Bildung beider Nebenprodukte und lieferte ein reines Produkt. Wurde ein Gemisch ohne TIPS verwendet, lieferte die Spaltung Produkte mit freiem Dimethoxybenzaldehyd. Peptide mit Cys(Dmb,Hpro)-Resten sollten demnach mit einem TFA/TIPS/Wasser/EDT-Gemisch gespalten werden (Tabelle 1).

H-Lys(Boc)-Cys(ΨDmb,Hpro)-Phe-Pro-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Pro-Asn(Trt)-Phe-Wang, gespalten mit TFA/TIPS/Wasser (oben)
Abbildung 4: HPLC-Profile von H-Lys(Boc)-Cys(ΨDmb,Hpro)-Phe-Pro-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Pro-Asn(Trt)-Phe-Wang-Rohpeptid, gespalten mit TFA/TIPS/Wasser (95:2,5/2,5; oben), TFA/EDT/Wasser (95:2,5/2,5; Mitte) und TFA/TIPS/Wasser/EDT (92,5:2,5/2,5/2,5; unten).

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Produkte

Pseudoprolin-Dipeptid
Bestellnummer
Fmoc-Ala-Cys(ΨDmp,Hpro) -OH 852381
Fmoc-Leu-Cys(ΨDmp,Hpro) -OH 852382
Fmoc-Val-Cys(ΨDmp,Hpro) -OH 852383
Fmoc-Lys(Boc)-Cys(ΨDmp,Hpro)-OH 852384

Referenzen

      1. a) T. Haack & M. Mutter (1992) Tetrahedron Lett., 33, 1589; b) M. Mutter, et al. (1995) Pept. Res., 8, 145.
      2. P. White, et al. in “Peptides 1998, Proc. of 25th European Peptide Symposium”, Budapest, Akadémiai Kiadó, 1998, pp. 120.
      3. C.C. Hyde, et al. (1994) Int. J. Peptide Protein Res., 43, 431.
      4. R. von Eggelkraut-Gottanka, et al. (2003) ChemBioChem, 4, 425.
      5. F. Shabanpoor, et al. (2007) J. Pept. Sci., 13, 113.
      6. a) P. White, et al. (2004) J. Pept. Sci., 10, 18; b) P. White, et al. (2003) Biopolymers, 71, 338.
      7. F. García-Martín, et al. (2006) Bipolymers, 84, 566.
      8. S. Abu-Baker & G. A. Lorigan (2006) Biochemistry, 45, 13312.
      9. V. Goncalves, et al. (2009) J. Pept. Sci., 15, 417.
      10. F. El Oualid, et al. (2010) Angew. Chem. Int. Ed., 49, 10149.
      11. S. N. Bavikar, et al. (2012) Angew. Chem. Int. Ed., 51, 758.
      12. P. Nagorny, et al. (2012) Angew. Chem. Int. Ed., 51, 975.
      13. C.C. Yves-Marie, et al. (2010) J. Pept. Sci., 16, 98.
      14. A. Ehrlich, et al. (1996) J. Org. Chem., 61, 8831.
      15. N. Schmiedeberg & H. Kessler (2002) Org. Lett., 4, 59.

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