Producto destacado: Fmoc-Asp(OEpe)-OH |
Variante modificada de Fmoc-Asp(OtBu)-OH
Pese a los muchos avances ocurridos en los últimos años, la formación de aspartimida sigue constituyendo un problema, en particular para la síntesis de péptidos largos debido a que la exposición repetida de la cadena peptídica en crecimiento a la piperidina lleva a la acumulación de productos secundarios relacionados con la aspartimida (Figura 1). Si bien en muchos casos las aspartimidas y las α y β piperididas generadas mediante esta reacción secundaria pueden ser fácilmente separadas del péptido diana mediante HPLC, los β-aspartil péptidos y el α-aspartil péptido epimerizado son casi imposibles de eliminar ya que suelen tener el mismo tiempo de retención que el péptido diana. Además, al tener la misma masa que la diana, es difícil detectar la presencia de esos productos secundarios.
Por consiguiente, la implantación de estrategias sintéticas que reduzcan al mínimo la formación de aspartimida es un requisito previo para la obtención de péptidos homogéneos que contengan aspartilo con buen rendimiento. Por esta razón, Novabiochem ha desarrollado la nueva unidad estructural Fmoc-Asp(OEpe)-OH, para la introducción de residuos de Asp en la síntesis peptídica Fmoc en fase sólida (SPPS).
Características y beneficios
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Más información sobre Fmoc-Asp(OEpe)-OH |
El Fmoc-Asp(OEpe)-OH es una variante modificada del Fmoc-Asp(OtBu)-OH en el cual el volumen estérico del grupo t-butilo aumenta por homologación lineal para contribuir a proteger el grupo aspartil β-carbonilo y, por tanto, reducir la formación de los productos secundarios de la aspartimida. En pruebas en las que se utiliza el péptido modelo bien establecido de la toxina II del escorpión, se observó que el uso de Fmoc-Asp(OEpe)-OH en vez de Fmoc-Asp(OtBu)-OH o de Fmoc-Asp(OMpe)-OH para la introducción del residuo de Asp reduce de manera notable la formación de aspartimida por tratamiento con piperidina a temperatura ambiente durante 10 minutos desde alrededor del 1,24 % con Asp(tBu) y el 0,4 % con Asp(OMpe) hasta solo el 0,13 % para las secuencias de Asp-Arg, y desde el 1,65 % para Asp(OtBu) y el 0,5 % para Asp(OMpe) hasta el 0,2 % para las secuencias Asp-Asn (Figuras 2 y 3, Tabla 1).
Para un péptido que contenga 40 aminoácidos con Asp-Asn C-terminal, esto se traduce en un aumento del rendimiento desde el 48 % hasta el 92 % si se utiliza Asp(OEpe) en vez de Asp(OtBu). Se observó que a 60 ºC, la utilización de Fmoc-Asp(OEpe)-OH era igual de eficaz (Tabla 1, Figura 4).
Fig. 1: Formación de aspartimida. Se muestran los posibles productos secundarios.
Asp(OR)-(X)
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Condiciones |
Producto [% del área] |
D/L-Aspartimidas [% del área] |
Piperidas [% del área] |
Por ciclo [%]a |
|---|---|---|---|---|---|
tBu
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piperidina a TH | 28,9 | 16,3 | 54,8 | 1,24 |
| piperidina a 60°C | 30,8 | 29,1 | 40,1 | 1,19 | |
Mpe
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piperidina a TH | 64,2 | 6,2 | 26,8 | ,4 |
| piperidina a 60°C | 63,5 | 16,9 | 19,6 | ,45 | |
Epe
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piperidina a TH | 87,8 | 3,6 | 8,6 | ,13 |
| piperidina a 60°C | 85,4 | 7,8 | 6,8 | ,16 | |
tBu
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piperidina a TH | 19,2 | 4,5 | 76,3 | 1,65 |
| piperidina a 60°C | 8,6 | 19,0 | 72,4 | 2,45 | |
Mpe
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piperidina a TH | 61,3 | 3,9 | 34,8 | ,49 |
| piperidina a 60°C | 51,4 | 11,1 | 37,5 | ,67 | |
Epe
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piperidina a TH | 82,7 | 3,4 | 14,9 | ,19 |
| piperidina a 60°C | 75,8 | 5,2 | 19,0 | ,28 |
Tabla 1: Composición de los productos no procesados obtenidos a partir de las VKDXYI peptidil resinas después del tratamiento con piperidina al 20 % en DMF a temperatura ambiente y a 60 °C. aCálculo de la descomposición por ciclo k: descomposición de primer orden: N = N0 • e-kt → k = -ln(N)/t ; N0 = 1; t = número de ciclos (100); N = % del área del péptido deseado. Basado en 10 min de tratamiento con piperidina al 20% en DMF/ciclo a temperatura ambiente y 2 minutos de tratamiento a 60 °C.
Figura 2: Perfiles UPLC de los péptidos VKDNYI brutos desanclados después del tratamiento con piperidina al 20% en DMF durante 18 h. 1: D/L aspartimidas. 2: producto. 3: D/L piperididas. A: hecho con Fmoc-Asp(OtBu)-OH; B: hecho con Fmoc-Asp(OMpe)-OH; C: hecho con Fmoc-Asp(OEpe)-OH.
Figura 3: Perfiles UPLC de los péptidos VKDRYI brutos desanclados después del tratamiento con piperidina al 20% en DMF durante 18 h. 1: D/L aspartimidas. 2: producto. 3: D/L piperididas. A: hecho con Fmoc-Asp(OtBu)-OH; B: hecho con Fmoc-Asp(OMpe)-OH; C: hecho con Fmoc-Asp(OEpe)-OH.
Figura 4: Perfiles UPLC de los péptidos VKDRYI brutos desanclados después del tratamiento con piperidina al 20% en DMF durante 2 h a 60 ̊C. 1: D/L aspartimidas. 2: producto. 3: D/L piperididas. A: hecho con Fmoc-Asp(OtBu)-OH; B: hecho con Fmoc-Asp(OMpe)-OH; C: hecho con Fmoc-Asp(OEpe)-OH.