Transferencias "Northern" y "Southern", y de colonias/placas de lisis

Transferencia "Southern"

Comparación directa de tres membranas de nylon cargado con sus propios protocolos optimizados: Para cada membrana, el "cross-linking" se realizó a la longitud de onda UV recomendada. Usando estas condiciones de "cross-linking", la membrana Immobilon-Ny+ obtuvo una señal de hibridación doble a la de sus dos competidores.

Intensidad de la señal después de 12 re-hibridaciones con sonda

32, cuatro hibridaciones simuladas, una séptima hibridación con sonda marcada con P-³²seguido de cinco hibridaciones simuladas y una 13ª hibridación con sonda marcada con P-³². Las membranas se sometieron a "stripping" en NaOH 0,4 M a 45 °C durante 30 min entre cada ciclo de hibridación. Las hibridaciones simuladas fueron iguales que las hibridaciones reales, excepto que no se añadía sonda marcada con P-³². Durante todo el proceso de hibridación con sonda, la membrana Immobilon-Ny+ funcionó mejor y consiguió una señal doble a la obtenida con las membranas de nylon cargado A y B de la competencia." />

El "cross-linking" de las membranas de nylon se realizó a 254 nm y se sometieron a múltiples hibridaciones incluyendo, en secuencia, dos hibridaciones con sonda marcada con P-³², cuatro hibridaciones simuladas, una séptima hibridación con sonda marcada con P-³²seguido de cinco hibridaciones simuladas y una 13ª hibridación con sonda marcada con P-³². Las membranas se sometieron a "stripping" en NaOH 0,4 M a 45 °C durante 30 min entre cada ciclo de hibridación. Las hibridaciones simuladas fueron iguales que las hibridaciones reales, excepto que no se añadía sonda marcada con P-³². Durante todo el proceso de hibridación con sonda, la membrana Immobilon-Ny+ funcionó mejor y consiguió una señal doble a la obtenida con las membranas de nylon cargado A y B de la competencia.

Sensibilidad de detección

La cantidad de ADN cargada en el gel se disminuyó hasta 0,01 ng. Las bandas de 2,2 y 2,0 kbp en la línea 0,1 corresponden a 0,48 y 0,42 pg de ADN, respectivamente. Esto es equivalente aproximadamente a una sola copia de la secuencia de un gen en 10 µg de ADN genómico humano. La sensibilidad mejoró al duplicar la concentración de sonda. En las líneas de 0,01 ng, la membrana Immobilon-Ny+ fue ligeramente más sensible con un ruido de fondo más bajo que la membrana A de la competencia.

Transferencia "Northern" con detección quimioluminiscente

El ARN total de hígado de ratón (1 µg) se separó en un gel de agarosa con formaldehído y se transfirió a una membrana Immobilon-Ny+ y a otra membrana "A" de nylon cargado positivamente de la compentencia mediante transferencia capilar. La fijación del ARN mediante "cross-linking" por UV mejoró la intensidad de la señal cuando se comparó con la fijación por calor en estufa. La membrana Immobilon-Ny+ muestra una mayor sensibilidad que la membrana "A" de la competencia.

Transferencia de colonias

2 a 254 nm. Después se hibridaron las membranas con una sonda de ADN marcada con P-³² y se visualizaron de imagen de fósforo." />

Una suspensión bacteriana mixta de JM109 con pUC19 o pLH2 (fragmento de 2,0 kbp de ADN del bacteriófago lambda digerido con Hind III clonado en pUC19) se echó en placas de agar LB y se incubó a 37 °C durante toda la noche. Después de enfriar las placas a 4 °C durante 30 minutos, las colonias (aproximadamente de 1–2 mm de diámetro) se transfirieron a un disco de 82 mm de membrana Immobilon-Ny+ o de una membrana de nylon de la competencia cargada positivamente. El ADN de la membrana se fijó por "cross-linking" con UV 60.000 µJulios/cm² a 254 nm. Después se hibridaron las membranas con una sonda de ADN marcada con P-³² y se visualizaron de imagen de fósforo.