Un'elevata copertura della sequenza con SeQuant® ZIC®-HILIC

Le colonne per HPLC SeQuant® ZIC® sono adatte per la mappatura dei peptidi, specialmente quando si devono studiare le informazioni fornite da frammenti peptidici idrofili. Grazie alla proficua combinazione della cromatografia a fase inversa e della tecnologia HILIC, le colonne forniscono informazioni tra loro complementari e possono essere accoppiate in un un sistema di mappatura peptidica 2D on-line.

Vari metodi per la mappatura dei peptidi

Per la mappatura peptidica si utilizza di frequente la cromatografia liquida – spettrometria di massa (LC-MS), poiché i lisati cellulari digeriti sono spesso troppo complessi per poter essere analizzati direttamente mediante spettrometria di massa (MS). Idealmente tutti i peptidi di una proteina o di una miscela di proteine digerite dovrebbero essere identificati grazie al loro spettro MS/MS ed al tempo di ritenzione. Sono stati sviluppati diversi metodi analitici e la cromatografia in fase inversa (RP) appare essere l'approccio analitico più comune. Tuttavia, il potere di risoluzione di una sola colonna RP non è sufficiente a separare ed identificare tutti i peptidi presenti.

Vantaggi delle separazioni SeQuant® ZIC®

Grazie alla combinazione della cromatografia a fase inversa (RPLC) e di interazione idrofila (HILIC), colonne per HPLC complementari consentono una copertura della sequenza molto maggiore rispetto ai tradizionali approcci RPLC monodimensionali. Diversi studi mostrano che questo metodo garantisce la combinazione più ortogonale possibile di due tecniche di separazione e la massima copertura offerta da una separazione 2D.

Le fasi stazionarie zwitterioniche SeQuant® ZIC® Merck offrono diversi vantaggi per la mappatura dei peptidi. Rispetto alla cromatografia a scambio cationico forte (SCX), le fasi stazionarie SeQuant® ZIC® offrono una risoluzione cromatografica molto migliore ed evitano il raggruppamento dei peptidi carichi. Poiché con le colonne SeQuant® ZIC® la separazione dipende dal pH del tampone, a bassi pH l'analisi consente la migliore ortogonalità con la RP e si avvicina molto a quella ottenuta con le resine SCX convenzionali. Tuttavia, in condizioni di pH neutro o debolmente basico, la risoluzione è migliore e garantisce l'acquisizione di informazioni più complete.

Gli eluenti utilizzati per le tecniche HILIC solitamente contengono un'elevata percentuale di solvente organico; pertanto, durante la manipolazione del campione, i peptidi idrofobi sono potenzialmente meno inclini a precipitare con queste colonne che nella cromatografia RP. Ciò significa che le colonne per cromatografia HILIC, benché siano utilizzate soprattutto per l'analisi delle molecole idrofile, sono adatte anche per identificare i peptidi idrofobi non rilevati con le colonne RP. Un'altra caratteristica della cromatografia HILIC è che con molte sequenze peptidiche ci si può attendere una maggiore sensibilità, a causa dell'elevata percentuale di solvente organico nella fase mobile che potenzia la volatilizzazione nel rivelatore.

Abbiamo illustrato l'impiego della tecnologia SeQuant® ZIC® per la mappatura dei peptidi con tre proteine digerite dalla tripsina: albumina serica bovina (BSA), citocromo C e ovalbumina. I risultati mostrano una maggiore copertura della sequenza e quindi una migliore caratterizzazione delle proteine. I link per la consultazione della documentazione e dei risultati sono disponibili nella sezione "Altre letture" della tabella sotto riportata.