Identificazione dei carboidrati in tutta semplicità – Anche in matrici difficili

SeQuant® ZIC® è la fase stazionaria ideale per la separazione e l'estrazione di glicani e glicopeptidi. Per evitare effetti di esclusione dimensionale sui glicani idratati le cui strutture presentano un volume idrodinamico relativamente elevato, si suggerisce l'impiego di un materiale con dimensioni dei pori di 200 Å. Le colonne per HPLC con DI ridotto sono adatte per i metodi LC/MS, mentre le colonne convenzionali, di diametro più ampio, meglio si adattano alla separazione di strutture glicaniche marcate per la rivelazione con altre tecniche.

Introduzione alla glicomica ed alla glicoproteomica

L'aggiunta di monosaccaridi alle proteine, processo noto col nome di glicosilazione, è una modificazione post-traduzionale (PTM) frequente nelle proteine. È ampiamente accettato che la glicosilazione delle proteine è coinvolta in numerosi processi essenziali per le cellule. Pertanto, le caratterizzazioni strutturali e funzionali di questi prodotti della PTM sono importanti per i settori della ricerca, in rapida crescita, della glicomica e della glicoproteomica.

Una delle principali difficoltà di queste discipline è l'incidenza della glicosilazione in quantità substechiometrica, a causa della notevole eterogeneità dei carboidrati legati (complessivamente detti glicani) e dell'occupazione solo parziale di un dato sito da parte dei glicani. Pertanto, per attenuare il problema, sono essenziali il frazionamento e l'arricchimento delle specie glicosilate. Tuttavia, le rilevanti caratteristiche idrofile di queste biomolecole, dovute ai numerosi gruppi idrossilici dei glicani, limita l'impiego delle tecniche cromatografiche tradizionali, come la cromatografia liquida a fase inversa (RPLC).

I vantaggi della tecnologia HILIC

Invece, la HILIC (cromatografia liquida ad interazione idrofila) è una tecnica cromatografica particolarmente interessante per l'analisi di questi glicoconiugati. Solitamente essa viene associata alla rivelazione in spettrometria di massa (MS) che garantisce sensibilità, accuratezza e risoluzione elevate, oltre ad un alto potenziale di produttività. Sono disponibili diverse fasi stazionarie per cromatografia HILIC con una gran varietà di gruppi funzionali; le fasi mobili solitamente contengono un'elevata concentrazione (40-97%) di solvente organico in acqua. Poiché la dissoluzione dei glicani e dei glicopeptidi può essere difficile se la concentrazione organica è molto alta, spesso la percentuale iniziale della componente organica nella fase mobile è dell'80%.

L'acetonitrile è di gran lunga il modificatore organico più popolare. Per idratare la fase stazionaria e ottenere risultati riproducibili dev'essere presente almeno il 3% di acqua. Tra i tamponi adatti citiamo acetato e formiato d'ammonio per la loro volatilità e l'eccellente solubilità nei solventi organici. Si è osservato che questi sali minimizzano le interazioni elettrostatiche (repulsioni o attrazioni) tra fasi stazionarie ed analiti carichi, cioè i glicoconiugati contenenti acidi sialici. Quando si utilizza l'associazione HILIC-MS, per aggiustare il pH normalmente si utilizzano formiato ed altri acidi deboli. La figura che segue mostra una panoramica delle tipiche sequenze operative negli studi di glicomica e glicoproteomica.

Sequenze operative tipiche negli studi di glicomica e glicoproteomica

Le fasi che coinvolgono la cromatografia HILIC sono evidenziate in rosso.