Une identification simple des hydrates de carbone (même dans les matrices complexes)

SeQuant® ZIC® est le sorbant idéal pour la séparation et l'extraction des glycanes et des glycopeptides. On recommande une phase stationnaire d'une dimension de pores de 200 Å pour éviter les effets d'exclusion par la taille du fait du volume hydrodynamique relativement grand des structures de glycanes hydratées. Les colonnes HPLC de faible D.I. sont adéquates pour les méthodes de LC/MS, tandis que les dimensions de colonnes classiques plus grandes conviennent mieux aux séparations de structures de glycanes marquées, détectées avec d'autres techniques.

Introduction à la glycomique des protéines et à la glycoprotéomique

La fixation de monosaccharides à des protéines, connue sous le nom de glycosylation des protéines, est une modification post-traductionnelle (PTM) répandue. Il est largement admis que la glycosylation des protéines est impliquée dans de nombreux procédés cellulaires essentiels. Les caractérisations structurelle et fonctionnelle de ces PTM sont donc importantes dans les domaines de recherche en rapide expansion que sont la glycomique et la glycoprotéomique.

Un des défis majeurs associés à ces disciplines est la présence substoïchiométrique de la glycosylation, résultant d'une grande hétérogénéité des hydrates de carbone liés (collectivement appelés glycanes), ainsi que d'une occupation seulement partielle d'un site donné par les glycanes. Le fractionnement et l'enrichissement des espèces glycosylées sont par conséquent essentiels pour atténuer ce problème. Cependant, l'importante hydrophilicité associée à ces biomolécules, qui découle des nombreux groupes hydroxyles du glycane, limite l'utilisation des techniques chromatographiques traditionnelles, telles que la chromatographie liquide en phase inverse (RPLC).

Les avantages de la technologie HILIC

En revanche, l'HILIC (chromatographie liquide d'interaction hydrophile) est une technique chromatographique séduisante pour l'analyse de ces glycoconjugués. Ces applications impliquent généralement une détection par spectrométrie de masse (MS) pour bénéficier de sa sensibilité, de sa précision et de sa résolution élevées, ainsi que de son potentiel de rendement élevé. Plusieurs phases stationaires HILIC avec des groupes fonctionnels différents sont disponibles et pour la phase mobile, on utilise généralement des solvants avec une concentration élevée en composés organiques (40-97 %) dans de l'eau. Puisqu'il peut s'avérer difficile de dissoudre les glycanes et les glycopeptides si la quantité de composés organiques est très élevée, une teneur organique de 80 % est souvent utilisée dans la phase mobile comme condition initiale.

L'acétonitrile est de loin le modificateur organique le plus utilisé. Pour hydrater la phase stationnaire et générer des résultats reproductibles, il convient d'utiliser au moins 3 % d'eau. Les sels d'ammonium (acétate et formiate) font partie des tampons adéquats en raison de leur volatilité et de leur excellente solubilité dans les solvants organiques. Il est avéré que ces sels minimisent les interactions électrostatiques (répulsion ou attraction) entre les phases stationnaires chargées et les analytes, c.-à-d. des acides sialiques contenant des glycoconjugués. Le formiate et d'autres acides faibles sont des additifs communément employés dans les phases mobiles pour ajuster le pH en cas d'utilisation de l'HILIC avec une détection MS en ligne. Un aperçu des procédures typiquement utilisées en glycomique et glycoprotéomique est présenté à la figure suivante.

Procédures typiquement utilisées en glycomique et glycoprotéomique

Les étapes impliquant l'HILIC sont indiquées en rouge.