Hohe Sequenzabdeckung mit SeQuant® ZIC®-HILIC

SeQuant® ZIC® HPLC-Säulen eigenen sich hervorragend zum Peptid-Mapping, insbesondere zur Untersuchung hydrophiler Peptidteile. Dank ihrer vorteilhaften Kombination aus Umkehrphasen- und HILIC-Technologie liefern die Säulen Informationen, die sich ergänzen. Zudem können sie an einen Online-2-D-Peptid-Mapping-Ansatz gekoppelt werden.

Verschiedene Methoden zum Peptid-Mapping

FlüssigkeitschromatographieLiquid chromatography – mass spectrometry (LC-MS) is frequently used for peptide mapping, since digested cell lysate is often too complex for direct mass spectrometric (MS) analysis. Ideally, all peptides of a digested protein or protein mixture should be identified by their MS/MS spectrum and retention time. Various analytical methods have been developed, with reversed phase (RP) chromatography being the most common approach. However, the resolving power of a single RP column is not sufficient to separate and identify all peptides present.-Massenspektrometrie (LC-MS) wird häufig für das Peptid-Mapping verwendet, weil aufgeschlossenes Zelllysat für die direkte massenspektrometrische (MS) Analyse häufig zu komplex ist. Idealerweise sollten alle Peptide eines aufgeschlossenen Proteins oder einer Proteinmischung über ihr MS/MS-Spektrum und ihre Retentionszeit identifiziert werden können. Dafür wurden verschiedene analytische Verfahren entwickelt, wobei die Umkehrphasen-Chromatographie der gebräuchlichste Ansatz ist. Jedoch reicht das Auflösungsvermögen einer einzigen RP-Säule oft nicht aus, alle vorhandenen Peptide zu trennen und zu bestimmen.

Vorteile der SeQuant® ZIC®-Trennung

Komplementäre HPLC-Säulen ermöglichen eine deutlich höhere Sequenzabdeckung als eindimensionale RPLC-Ansätze, da sie auf der Kombination von Umkehrphasen- (RPLC) und hydrophiler Interaktionschromatographie (HILIC) beruhen. Mehrere Studien haben gezeigt: Diese Methode ist die am meisten orthogonale Kombination von Trennverfahren mit der höchsten Abdeckung im zweidimensionalen Trennraum.

Die zwitterionischen SeQuant® ZIC®-HILIC-Säulen von Merck bieten klare Vorteile für das Peptid-Mapping. Im Vergleich zu starker Kationenaustauschchromatographie (SCX) bietet SeQuant® ZIC® eine deutlich bessere chromatographische Auflösung und verhindert zugleich die Cluster-Bildung geladener Peptide. Da die Trennung mit SeQuant® ZIC® vom pH-Wert des Puffers abhängt, ermöglicht die Analyse bei niedrigen pH-Werten die beste Orthogonalität mit RP und ist mit der herkömmlichen SCX-Trennung vergleichbar. Jedoch ermöglichen nMerck's zwitterionic SeQuant® ZIC® stationary phases offer distinct advantages for peptide mapping. Compared to strong cation exchange chromatography (SCX), SeQuant® ZIC® provides significantly better chromatographic resolution and prevents clustering of charged peptides. Since separation with SeQuant® ZIC® is dependent on buffer pH, analysis at low pH allows best orthogonality with RP, and resembles conventional SCX separation. However, neutral or slightly basic pH conditions enable better resolution, resulting in more comprehensive data acquisition.eutrale oder leicht basische pH-Werte eine bessere Auflösung und liefern deutlich mehr Daten.

HILIC-Eluente enthalten üblicherweise einen hohen Prozentsatz organisch löslicher hydrophober Peptide. Dadurch sind sie während der Probenbehandlung an der Säule weniger abscheidungsanfällig als bei der RP-Chromatographie. Das heißt: Obwohl sie normalerweise zur Analyse hydrophiler Moleküle eingesetzt werden, lassen sich HILIC-Säulen auch verwenden, um hydrophobe Peptide zu identifizieren, die mit einer RP-Säule nicht nachweisbar sind. Ein weiterer Vorteil von HILIC: Eine höhere Sensibilität für viele Peptid-Sequenzen ist zu erwarten. Denn der hohe Prozentsatz organischen Inhalts in der mobilen Phase verbessert die Verflüchtigung im Detektor.

Wie nützlich die SeQuant® ZIC®-Technologie für das Peptid-Mapping ist, wurde am Beispiel von drei Trypsin aufgeschlossenen Proteinen gezeigt: Rinderserumalbumin (BSA), Cytochrom C und Ovalbumin. Die Ergebnisse belegen eine höhere Sequenzabdeckung und damit auch eine bessere Charakterisierung der Proteine. Links zu den Dokumenten und Ergebnissen finden Sie unter "Weiterführende Literatur" unten.