Einfache Bestimmung von Kohlenhydraten – selbst in komplizierten Matrizen

SeQuaDas SeQuant® ZIC®-HILIC-Sorbens ist hervorragend geeignet, Glykane und Glykopeptide zu trennen und zu extrahieren. Die Porengröße des Materials von 200 Å ist häufig ratsam, um Größenausschlusseffekte zu vermeiden, die aus dem relativ hohen hydrodynamischen Volumen wasserhaltiger Glykanstrukturen resultieren. Kleine ID-HPLC-Säulen sind optimal für LC/MS-Setups. Größere, herkömmliche Säulenlängen eignen sich hingegen besser zur Trennung markierter Glykanstrukturen, die zudem mit anderen Techniken bestimmt werden.

Einführung in die Protein-Glykomik und -GlykIntroduction to Protein Glycomics and Glycoproteomicsoproteomik

Die Anlagerung von Monosacchariden an Proteine, bekannt als Glykosylierung, ist eine häufige posttranslationale Modifikation (PTM). Es ist bekannt, dass die Glykosylierung von Proteinen an vielen entscheidenden Zellprozessen beteiligt ist. Deshalb ist die strukturelle und funktionelle Charakterisierung dieser PTMs im schnell wachsenden Bereich der Glykomik- und Glykoproteomikforschung wichtig.

Eine der zentralen Herausforderungen dabei ist das unterstöchiometrische Vorkommen der Glykosylation. Diese resultiert aus einer erheblichen Heterogenität der angelagerten Kohlenhydrate (die unter dem Sammelbegriff Glykane zusammengefasst werden) sowie einer nur teilweisen Glykananlagerung an einer Stelle. Ensprechend ist die Fraktionierung und Anreicherung der glykoselierten Sorten unerlässlich. Jedoch haben diese Biomoleküle eine signifikante Hydrophilie, die sich aus den zahlreichen Hydroxylgruppen der Glykane ergibt. Traditionelle Chromatographie-Techniken wie etwa die Umkehrphasen-Flüssigkeitschromatographie (RPLC) lassen sich daher nur begrenzt einsetzen.

Vorteile der HILIC-Technologie

Hingegen ist das Flüssigkeitschromatographieverfahren HILIC (hydrophilic interaction liquid chromatography) eine interessante Technik zur Analyse dieser Glykokonjugate. Anwendungen schließen meistens den Nachweis mit Massenspektrometrie (MS) ein, um von der hohen Empfindlichkeit, Genauigkeit und Auflösung sowie dem großen Durchsatz zu profitieren. Verschiedene stationäre HILIC-Phasen mit unterschiedlichen Funktionsgruppen sind verfügbar. Üblicherweise werden Lösungsmittel mit hohem Gehalt organischer Bestandteile (40-97 %) in Wasser für die mobile Phase verwendet. Da die Auflösung von Glykanen und Glykopeptiden schwierig sein kann, wenn der Anteil organischer Bestandteile sehr hoch ist, wird in der mobilen Phase oft eine Ausgangsbedingung mit 80 % organischen Bestandteilen gewählt.

Acetonitril ist der beliebteste organische Modifikator. Um die stationäre Phase zu hydratisieren und reproduzierbare Ergebnisse zu bekommen , sollten mindestens 3% Wasser enthalten sein. Geeignete Puffer beinhalten Ammoniumsalze (Acetat und Formiat). Sie werden wegen ihrer Flüchtigkeit und ausgezeichneten Löslichkeit im organischen Lösungsmittel verwendet. Es hat sich gezeigt, dass diese Salze die elektrostatischen Wechselwirkungen (Abstoßung und Anziehung) zwischen den geladenen stationären Phasen und den Analyten (Glykokonjugate enthaltende Sialinsäuren) minimieren. Formiate und andere schwache Säuren sind häufig verwendete Additive zur Einstellung des pH-Wertes für mobile Phasen, wenn HILIC-MS-Online-Setups verwendet werden. Einen Überblick der typischen Arbeitsabläufe in der Glykomik und Glykoproteomik bietet die folgende Abbildung.

Typische Arbeitsabläufe in der Glykomik und Glykoproteomik

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