Transferts northern et Southern, et hybridations plaques/colonies
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Aperçu
Millipore offre un grand choix de membranes de transfert pour les applications sur les acides nucléiques. Pour d'excellents résultats de transferts Southern, northern et d'hybridations plaques/colonies, nous recommandons la membrane de transfert Immobilon-Ny+ chargée positivement. Les membranes de transfert en nitrocellulose Immobilon-NC, originellement utilisées dans les protocoles de Southern et d'hybridations plaques/colonies, sont également proposées en tant que solution plus économique mais moins sensible.
Membrane de transfert Immobilon-Ny+ chargée positivement
La membrane Immobilon-Ny+ est une membrane en nylon chargée positivement qui a été optimisée pour permettre des transferts, des immobilisations, des hybridations et des réhybridations fiables et reproductibles. La densité et l'uniformité de la surface chargée positivement procurent une sensibilité maximale avec un bruit de fond minimum. La membrane est renforcée afin d'améliorer sa résistance, une caractéristique particulièrement importante pour les réhybridations.
Des protocoles détaillés sont disponibles afin d'optimiser les résultats de transferts réalisés avec nos membranes Immobilon-Ny+.
- Une sensibilité maximale avec un bruit de fond minimum
- Des qualités exceptionnelles pour la réhybridation
- Bonne performance avec les systèmes de détection par chimiluminescence comme avec ceux par radioactivité
Performances
Transfert Southern
Comparaison directe de trois membranes en nylon chargé en utilisant leurs propres protocoles optimisés : chaque membrane a été exposée à sa longueur d'onde U.V. de fixation recommandée. Dans ces conditions de fixation, la membrane Immobilon-Ny+ présente un signal d'hybridation double de celui des membranes concurrentes.
Intensité du signal après 12 réhybridations
La fixation sur les membranes en nylon a été faite à 254 nm. Ces dernières ont été soumises à de multiples réhybridations, à savoir, dans l'ordre, deux hybridations avec une sonde marquée au P32, quatre pseudo-hybridations, une septième hybridation avec une sonde marquée au P32 suivie de cinq pseudo-hybridations et une treizième hybridation avec une sonde marquée au P32. Les membranes ont été déshybridées avec du NaOH 0,4 M à 45 °C pendant 30 minutes entre chaque cycle d'hybridation. Les pseudo hydridations étaient identiques aux vraies hydridations sauf que la sonde marquée au P32 n'était pas ajoutée. Tout au long des cycles de réhybridation, la membrane Immobilon-Ny+ s'est mieux comportée en produisant un signal double de celui des membranes concurrentes A et B en nylon chargé.
Sensibilité de la détection
La quantité dADN chargée sur le gel a été réduite jusqu'à 0,01 ng. Les bandes à 2,2 et 2,0 kbp dans la ligne 0,1 correspondent respectivement à 0,48 et 0,42 pg d'ADN. Cela correspond environ à la séquence d'un gène simple copie dans 10 µg d'ADN génomique humain. La sensibilité a été améliorée en doublant la concentration de la sonde. Dans les lignes 0,01 ng, la membrane Immobilon-Ny+ était légèrement plus sensible avec moins de bruit de fond que la membrane concurrente A.
Transfert northern avec détection par chimiluminescence
L'ARN total de foie de souris (1 µg) a été séparé sur gel d'agarose au formaldéhyde puis transféré sur une membrane Immobilon-Ny+ ainsi que sur une membrane concurrente "A" en nylon chargée positivement par transfert capillaire. La fixation de l'ARN par exposition aux U.V. améliore l'intensité du signal comparée à la fixation par chauffage. La membrane Immobilon-Ny+ montre une meilleure sensibilité par rapport à la membrane concurrente A.
Transferts de colonies
Une suspension bactérienne de JM109 portant les plasmides pUC19 ou pLH2 (fragment de 2,0 kbp de l'ADN du phage lambda digéré par Hind III cloné dans pUC19) a été mise en culture sur gélose LB en boîtes de Pétri et incubée à 37 °C pendant 18 heures. Après avoir réfrigéré les boîtes à 4 °C pendant 30 minutes, les colonies (d'environ1–2 mm de diamètre) ont été transférées sur un disque de 82 mm de membrane Immobilon-Ny+ ou de membrane concurrente en nylon chargée positivement. L'ADN collecté sur la membrane a été fixé par exposition aux U.V. à raison de 60 000 µJoules/cm2 à 254 nm. Les membranes ont alors été hybridées avec une sonde marquée au P32 et visualisées avec un système d'imagerie pour radio-isotope.
Membrane de transfert Immobilon-NC
Les membranes Immobilon-NC offrent une solution économique pour les protocoles de transfert des acides nucléiques et des protéines. Ces membranes de transfert en nitrocellulose furent les matrices originelles utilisées dans les protocoles de transfert Southern, d'hybridations plaques/colonies et de transfert de protéines. La membrane NC HATF est en esters de cellulose sans aucun surfactant afin de préserver l'intégrité des parois cellulaires pendant la culture des cellules. On utilise ces membranes pour les transferts de colonies. La membrane NC HAHY est en esters de cellulose avec des surfactants qui améliorent sa mouillabilité et sa manipulation pendant le processus de transfert. Les deux membranes possèdent une forte capacité à fixer les acides nucléiques et les protéines. Elles conviennent aux transferts dans le cadre d'applications en routine.