Atteindre un pourcentage de séquence couverte élevé grâce à SeQuant® ZIC®-HILIC

Les colonnes d'HPLC SeQuant® ZIC®-HILIC conviennent à la cartographie peptidique et sont par conséquent adaptées lorsqu'il s'agit d'explorer les informations provenant de fragments de peptides hydrophiles. Grâce à la combinaison avantageuse de la chromatographie de phase inverse et de l'HILIC, ces colonnes fournissent des informations complémentaires et peuvent être couplées à une cartographie peptidique bidimensionnelle en ligne.

Les diverses méthodes employées pour la cartographie peptidique

La LC-MS (chromatographie liquide – spectrométrie de masse) est fréquemment utilisée pour la cartographie peptidique, car le lysat cellulaire digéré est souvent trop complexe pour une analyse directe en spectrométrie de masse (MS). Dans l'idéal, tous les peptides d'une protéine ou d'un mélange protéique digéré(e) devraient être identifiés par leur spectre et leur temps de rétention en MS/MS. Différentes méthodes analytiques ont été développées, la chromatographie de phase inverse étant l'approche la plus commune. Toutefois, le pouvoir de séparation d'une seule colonne de phase inverse n'est pas suffisant pour séparer et identifier tous les peptides présents.

Les avantages de la séparation SeQuant® ZIC®

Basées sur la combinaison de la phase inverse (RPLC) et de la chromatographie d'interaction hydrophile (HILIC), des colonnes HPLC complémentaires permettent une couverture de séquence bien supérieure à celle des approches RPLC unidimensionnelles classiques. Plusieurs études ont montré que cette méthode peut être considérée comme la combinaison de techniques séparatives la plus orthogonale offrant la couverture la plus élevée d'un espace de séparation bidimensionnel.

Les phases stationnaires zwitterioniques SeQuant® ZIC® de Merck présentent de sérieux avantages pour la cartographie peptidique. Par rapport à une chromatographie d'échange de cations forts (SCX), SeQuant® ZIC® permet une séparation chromatographique bien meilleure et évite l'agrégation des peptides chargés. Comme la séparation avec SeQuant® ZIC® dépend du pH du tampon, l'analyse à pH faible permet une meilleure orthogonalité avec la RP et ressemble à une séparation SCX classique. Toutefois, des conditions de pH neutres ou légèrement basiques permettent une meilleure résolution, entraînant une acquisition de données plus complète.

Les éluants HILIC contiennent généralement un pourcentage élevé des peptides hydrophobes du solvant organique. Ils sont donc potentiellement moins susceptibles de précipiter pendant la manipulation de l'échantillon sur la colonne qu'en chromatographie de phase inverse. Cela signifie que les colonnes HILIC, bien qu'elles soient surtout utilisées pour l'analyse des molécules hydrophiles, peuvent également l'être pour identifier les peptides hydrophobes non détectés avec une colonne RP. Une autre caractéristique de l'HILIC est que l'on peut s'attendre à une sensibilité supérieure pour de nombreuses séquences peptidiques. Cela est également dû à la teneur organique élevée de la phase mobile qui améliore la volatilisation dans le détecteur.

L'utilisation de la technologie SeQuant® ZIC® pour la cartographie peptidique a été démontrée avec trois protéines digérées par la trypsine, la sérum albumine bovine (BSA), le cytochrome c et l'ovalbumine. Les résultats démontrent une couverture de séquence supérieure et donc une meilleure caractérisation des protéines. Vous trouverez des liens aux documents et aux résultats dans la section "Suggestions de lecture" ci-dessous.